MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV FYZIKY KONDENZOVANÝCH LÁTEK
DETEKCE ELEKTRONŮ V MIKROSKOPII A MODIFIKACE DETEKTORŮ PRO ANALÝZU SPECIFICKÝCH BIOLOGICKÝCH PREPARÁTŮ
Diplomová práce
Ondřej Židek
Vedoucí práce: prof. RNDr. Vojtěch Mornstein, CSc.
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Bc. Ondřej Židek Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav fyziky kondenzovaných látek Detekce elektronů v mikroskopii a modifikace detektorů pro analýzu specifických biologických preparátů
Studijní program:
Fyzika
Studijní obor:
Biofyzika
Vedoucí práce:
prof. RNDr. Vojtěch Mornstein, Csc.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
97
Klíčová slova:
Elektronová mikroskopie, elektron, skenovací transmisní elektronové mikroskopy, freezeetching, buněčné membrány
2
Bibliographic Entry Author:
Bc. Ondřej Židek Faculty of Science, Masaryk University Department of condensed matter physics
Title of Thesis:
Detection of electrons in the microscopy and the modification of detectors for analysis of specific biological specimens
Degree programme:
Physics
Field of Study:
Biophysics
Supervisor:
prof. RNDr. Vojtěch Mornstein, CSc.
Academic Year:
2O12/2O13
Number of Pages:
97
Keywords:
Electron microscopy, electron, scanning transmission electron microscope, freezeetching, cell membrane
3
Abstrakt V této diplomové práci se budeme zabývat elektronovou mikroskopií, nejprve popíšeme problematiku elektronové mikroskopie (s důrazem na optimální detekci elektronů a modifikace detektorů pro analýzu specifických biologických preparátů), včetně metod přípravy preparátů a nastíníme si základní charakteristiku biomembrán. V kapitole „metodika“ popíšeme parametry mikroskopu, na němž probíhalo měření. V této kapitole bude též popsán preparát, který byl připraven
klasickou
chemickou
cestou.
Budeme
používat
různé
detektory (detektor sekundárních elektronů, detektor zpětně odražených elektronů,
detektor
prošlých
elektronů,
detektor
sekundárních
elektronů v nízkém vakuu) s cílem získání co nejlepšího výstupního signálu. S ohledem na to, že preparáty jsou biologické vzorky, bylo nutno značně modifikovat pracovní nastavení mikroskopu pro každý preparát zvlášť. Preparáty byly většinou připraveny metodou freeze-etching (mrazové leptání) a pozorovány skenovacím elektronovým mikroskopem. Jednalo se o buňky lidské
promyeloidní leukémie (HL-60), u kterých jsme se
zaměřili hlavně na membrány. Tyto buňky byly současně pozorovány na transmisním elektronovém mikroskopu, což umožnilo srovnání obou metod snímání.
4
Abstract In this thesis, we will deal with the electron microscopy. Firstly, we will describe the issue of the electron microscopy (with the emphasis on the optimal detection of electrons and modifications of detectors for the specific biological sample analysis) including the methods of the specimen preparation and we will outline the basic characteristics of biomembranes. In the chapter „methodology“, we will describe the parameters of the microscope, which the measurement was enacted with. In this chapter, the preparation will also be described, which was prepared by the classic chemical way. We will use different detectors (a secondary electron detector, a backscattered electron detector, a transmitted electron detector and a low vacuum secondary electron detector) with the aim of getting the best output signal. In view of the fact that the preparations are biological samples, it was necessary to modify operational setting of the microscope for each preparation separately. The preparations were mostly prepared by the freeze-etching method and observed by the electrone scanning microscope. The preparations were cells of the human leukemia (HL-60) and we focused mainly to their membranes. These cells were simultaneously observed with the transmissive electrone microscope, which enabled the comparison of both methods of scanning.
5
6
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat vedoucímu své diplomové práce prof. RNDr. Vojtěchu Mornsteinovi, CSc a Mgr. Naděždě Vaškovicové za podnětné konzultace při práci s elektronovým mikroskopem a replikami. Dále děkuji pracovníkům firmy TESCAN Kristýně Rosíkové a Vratislavu Košťálovi za vedení práce na mikroskopu. Dále děkuji Ing. Pavlu Nádaskému za pomocné rady při zpracování naměřených dat. Na závěr bych chtěl poděkovat své rodině za finanční a psychickou podporu při studiu.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 13.prosince 2012
……………………………… Jméno Příjmení
7
Obsah 1.Úvod ............................................................ 11 2. Přehled problematiky .................................. 12 2.1. Elektronová mikroskopie.................................... 12 2.1.1. Historie elektronové mikroskopie ...................................12 2.1.1.1. Historie elektronové mikroskopie v Brně .....................13 2.1.2. Dělení elektronové mikroskopie .....................................14 2.1.2.1. Skenovací elektronová mikroskopie SEM.....................15 2.1.2.1.1. Části a stavba elektronového mikroskopu SEM .........16 2.1.2.2. Transmisní elektronová mikroskopie TEM ...................17 2.1.2.2.1. Části a stavba elektronového mikroskopu TEM .........18 2.1.2.3. Skenovací transmisní elektronová mikroskopie ...........19 2.1.2.3.1. Části a stavba mikroskopu STEM ..............................19 2.1.2.4. Nízkonapěťová elektronová mikroskopie LVEM............20 2.1.3. Interakce elektronů s preparátem, vznik signálů ............20 2.1.3.1. Elektron ......................................................................21 2.1.3.2. Signály vznikající při interakci elektronů s preparátem...............................................................................21 2.1.4. Rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu ..........23 2.1.4.1. Vady elektronového mikroskopu..................................24 2.1.4.2. Vliv urychlovacího napětí ............................................25 2.1.5. Příprava preparátů pro elektronovou mikroskopii ...........27 2.1.5.1. Příprava preparátů pro SEM vs. TEM............................27 2.1.5.1.1. Příprava preparátů pro TEM ......................................27 2.1.5.1.2. Příprava preparátů pro SEM ......................................28 2.1.5.2. Fyzikální a chemická cesta přípravy ............................29 2.1.5.2.1. Příprava preparátů fyzikální cestou ..........................29 2.1.5.2.2. Příprava preparátů chemickou cestou .......................30 8
2.2. Membránové struktury…………………………………….32 2.2.1. Biologická membrána ...................................................... 32 2.2.2. Struktura biologických membrán..................................... 33 2.2.2.1. Lipidová dvojvrstva ...................................................... 34 2.2.2.2. Membránové proteiny ................................................... 36 2.2.3. Jaderná membrána .......................................................... 37 2.2.4. Cytoplazmatická membrána ............................................ 38
2.3. Kryotechniky ...................................................... 39 2.3.1. Metoda freeze-etching ..................................................... 39 2.3.1.1. Historie freeze-etchingu ............................................... 40 2.3.2. Zamrazování biologického preparátu ............................... 40 2.3.2.1. Kryoprotektiva ............................................................. 42 2.3.3. Kryogenní mrazící metody............................................... 42 2.3.4. Fracturing (lámání) .......................................................... 44 2.3.4.1. Lomné plochy biologických materiálů........................... 46 2.3.5. Etching (leptání) .............................................................. 46 2.3.6. Stínování a formování repliky.......................................... 47 2.3.7. Čištění repliky................................................................. 48 2.3.8. Artefakty ......................................................................... 49
3. Cíl práce ...................................................... 50 4.Metodika ....................................................... 51 4.1. Mikroskop Mira 3 FEG-SEM ................................. 51 4.1.1. Elektronově otpická soustava a vakuový systém.............. 52 4.1.2. Zobrazovací režimy.......................................................... 52 4.1.3. Detektory ........................................................................ 53 4.1.4. Práce s mikroskopem Mira 3 FEG-SEM ............................ 54
4.2. Příprava některých preparátů .............................. 56
5. Výsledky ...................................................... 57 9
5.1. Biologický popis preparátu .................................. 58 5.2. Porovnání metody STEM-BF a STEM-DF............... 61 5.3. Vliv urychlovacího napětí na kvalitu snímku ....... 62 5.3.1. Klesající urychlovací napětí vs. kvalita snímku ............... 63 5.3.2. Změna urychlovacího napětí za stálého poměru jasu a kontrastu………………………………………………………………………….65
5.4. Artefakty vzniklé nevhodným nastavením přístroje a chybnou přípravou biologického preparát... 67 5.4.1. Nabíjení preparátu ........................................................... 67 5.4.2. Rozostřené snímky .......................................................... 68 5.4.2.1. Topografie preparátu ovlivňující ostrost snímku ........... 69 5.4.3. Některé artefakty vzniklé při přípravě replik metodou freeze-etching ........................................................................... 70 5.4.3.1. Vitrifikace .................................................................... 71 5.4.3.2. Špatně vymytá replika.................................................. 72 5.4.4. Vypalování zorného pole.................................................. 73
5.5. Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku ..... 73 5.6. Porovnání snímků z TEM a STEM detektoru ........ 76 5.7. Snímky různých preparátů pořízené různými detektory ................................................................... 78
6. Diskuze ........................................................ 81 6.1. Porovnání snímků metody STEM-BF a STEM-DF .. 81 6.2. Porovnání snímků s různým urychlovacím napětím………….81
6.3. Porovnání chybných snímků a snímků s artefakty.............. 84 6.4. Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku .................... 88 6.5. Porovnání snímků z TEM a STEM detektoru ....................... 90 6.6. Snímky pořízené za pomoci různých detektorů .................. 91 7. Závěr ..................................................................................... 92 8. Literatura .............................................................................. 95
10
1.
Úvod
Elektronová mikroskopie je velice rychle se rozvíjející laboratorní metodou a elektronový mikroskop je stále častěji součástí vybavení různých badatelských laboratoří. Tato práce by nás měla seznámit s problematikou optimalizace nastavení elektronového mikroskopu při zkoumání biologických preparátů, které byly připraveny různými tradičními i netradičními metodami. Jedná se zejména o metodu freezeetching (mrazové leptání) za použití TE detektoru (transmitted electrons detector = detektor prošlých elektronů) v mikroskopu SEM (skenovací elektronový mikroskop). V této práci jsme pracovali se snímky buněk lidské leukémie HL-60, jejich organel, přesněji pak jaderné membrány se zvláštním zřetelem k transmembránovým proteinům a jaderným pórům. Výše zmíněné objekty dokáže kvalitně zobrazit i TEM (transmisní elektronový mikroskop), což jsme pro srovnání také udělali, ale naším hlavním cílem bylo pokusit se nastavit limitně parametry mikroskopu STEM tak, abychom se snímkům z TEM maximálně přiblížili. SEM mikroskopy jsou velmi dobré ve vykreslení povrchu, protože sbírají informace z malého interakčního objemu, což se nám u snímků replik současně hodilo pro náš další úkol co nejlépe vykreslit membrány a zhodnotit jejich topografii povrchu.
11
2.
Přehled problematiky
2.1. Elektronová mikroskopie 2.1.1.
Historie elektronové mikroskopie
Základ elektronové mikroskopii položil svým objevem J. J. Thompson, který roku 1897 objevil elektron (Wilson R. 1997). Další pomyslný střípek do mozaiky elektronové mikroskopie přiložil francouzský fyzik Louis de Broglie, který roku 1925 navrhl princip duality částic a vlnění (1),
λ=
h h = p mv
(1)
kde h je Planckova konstanta (6,626·10-34 Js) v rychlost částice, p hybnost částice a m hmotnost částice (9,109·10-31kg). Jeho návrh potvrdili o dva roky později Davisson s Germerem a Thompson s Reidem za pomoci elektronové difrakce, která definitivně potvrdila jak vlnový tak korpuskulární charakter elektronů. Dalším krokem ke zkonstruování elektronového mikroskopu byla práce H.Busche, který se zabýval analogií mezi vychylováním elektronového toku solenoidem (magnetickým polem) a světelného toku za pomoci skleněných čoček. Největším počinem pro vznik elektronové mikroskopie bylo zkonstruování první elektromagnetické čočky, které je připsáno Ernstu Ruskovi (Nebesářová J. 2001). Tyto a mnohé další poznatky přispěly ke konstrukci prvního elektronového mikroskopu (r. 1931). Povedlo se to skupině vědců, vedené Ernstem Ruskou a Maxem Knollem. Dle dnešního dělení elektronové mikroskopie se jednalo o transmisní elektronový mikroskop. Tento objev odstartoval masovou výrobu těchto přístrojů. První firmou, která vyráběla elektronové mikroskopy ve velkém byla firma Siemens und Halske (r. 1938). Rozlišovací schopnost těchto mikroskopů dosahovala 10nm. S velkým odstupem času, dva roky před svou smrtí dostává německy
fyzik
Ernst
Ruska
Nobelovu
cenu
za
návrh
prvního
elektronového mikroskopu (Bystrický V. 1962) Transmisní elektronový mikroskop už byl na světě, ale skenovací elektronový mikroskop si musel ještě chvilku počkat. Nejdříve musel 12
popsat německý fyzik M. von Ardenne (r. 1938) teoreticky i prakticky rastrování u transmisního elektronového mikroskopu, což byl první krok
pro
konstrukci
skenovacích
(rastrovacích)
elektronových
mikroskopů. Vlastní skenovací elektronový mikroskop (r. 1939) sestrojil poprvé až americký vědec a průkopník televize Vladimir Zworykin, který též vynalezl fotonásobič a použil ho k detekci sekundárních elektronů. Konstrukcí skenovacího elektronového mikroskopu se ve stejné době zabývala v Anglii skupina vědců vedená C. W. Oatleyem a výsledky jejich práce byly použity k výrobě komerční verze firmou Cambridge Scientific Instruments v roce 1965 ( Nebesářová J. 2001). 2.1.1.1.
Historie elektronové mikroskopie v Brně
Zakladatelem elektronové mikroskopie v někdejším Československu je prof. Armin Delong. Ještě jako student prof. Bláhy na VUT v Brně prováděl pokusy s elektronovými čočkami (50. léta 20. století). Roku 1950 sestrojil společně s V. Drahošem a L. Zobačem v Československu první elektronový mikroskop (obr. 1). Tato skupina pokračovala ve výrobě elektronových mikroskopů a laboratoř
Československé
akademie
založila Elektronově-optickou věd
(později
součást
Ústavu
přístrojové techniky AV ČR).
Obrázek 1: První elektronový mikroskop v Československu Několik
kusů
těchto
elektronových
mikroskopů
vyrobila
Československá firma Tesla, mikroskop nesl označení Tesla BS241. 13
Mikroskop
pracoval
s urychlujícím
napětím
50
kV,
rozlišení
se
pohybovalo okolo 2 nm a bylo limitováno osovým astigmatismem. Skupina vědců spolupracovala a přes stolní elektronový mikroskop se dostala až k transmisnímu elektronovému mikroskopu s urychlovacím napětím 100 kV, později dokonce až 150 kV. Rozlišení tohoto mikroskopu teoreticky dosahovalo 0,2 nm (r. 1968). Delong zkoušel různé úpravy mikroskopu, zkonstruoval první emisní elektronový mikroskop, který nebyl nikdy masově vyráběn. Roku 1996 spatřil v České
republice
elektronový
světlo
mikroskop,
světa
ve
první
kterém
se
enviromentálni
skenovací
daly
preparáty
pozorovat
v nativním stavu. V současné době sídlí v Brně tři větší firmy zabývající se elektronovou mikroskopií, je to firma FEI, která má svá tři největší sídla v Holandsku (Eindhoven), v Americe (Hilsboroo) a v České republice (Brno). Pak je to česká firma TESCAN a v neposlední řadě firma Delong instruments (www.isibrno.cz/~mih/muzeum/muzeumen.htm). 2.1.2.
Dělení elektronové mikroskopie
Elektronová mikrokospie je fyzikální metoda, která nám podává informace o nanostruktuře a složení preparátu. Preparát je při této fyzikální metodě zkoumán elektronovým svazkem. Elektrony se uvolňují většinou
emisí
urychlovacím
z katody
napětím,
a
což
jsou je
urychlovány
velmi
důležitý
směrem provozní
k anodě parametr
elektronových mikroskopů. Celý děj probíhá ve vakuu (aby elektrony nebyly zpomaleny nebo vychylovány ze svého původního směru molekulami vzduchu či jinými nečistotami), díky němuž se zvětšuje účinný průřez (pravděpodobnost interakce elektronu s preparátem). Svazek je zaostřován soustavou elektromagnetických čoček na preparát, aby bylo dosaženo potřebného zvětšení. Signál, který vidíme, vzniká interakcí elektronů s preparátem. Podle
způsobu
jak
vzniká
obraz,
jaké
je
uspořádání
celého
elektronového mikroskopu, popřípadě jaká je kombinace detektorů, rozlišujeme několik druhů elektronové mikroskopie. 14
2.1.2.1.
Skenovací elektronová mikroskopie SEM
Skenovací elektronové mikroskopy se používají po celém světě, zejména na poli výzkumu a průmyslu. SEM dosahuje vyššího prostorového rozlišení než dosahují aktuální optické mikroskopy. SEM nabízí mnoho analytických režimů, přičemž každý z nich dává informace o fyzikálních, chemických či elektrických vlastnostech části či celého vzorku. V SEM paprsek elektronů rastruje, neboli skenuje přesně po povrchu preparátu bod po bodu v přesném obdélníkovém vzoru, kterému
se
říká
rastrovací
stopa.
Elektrony
jsou
emitovány
z elektronového zdroje a následně jsou urychlovány směrem k anodě a směřovány do elektronového tubusu urychlovacím napětím o hodnotě obvykle mezi 0,1 kV – 30 kV. Elektrony na cestě k preparátu proletí soustavou elektromagnetických čoček, kde proběhne zmenšení průměru paprsku z velikosti několika milimetrů na velikost několika nanometrů (Bullivant S. 2009). Po interakci primárního elektronového svazku se vzorkem se uvolňjí sekundární elektrony a další druhy signálů, které jsou následně detekovány příslušným detektorem. Základním principem je, že letící sekundární
elektron
dopadne
na
scintilátor
s fotonásobičem,
fotonásobič kaskádovitě zesiluje signál a určuje tak intenzitu paprsku na obrazovce (Šuškin N.G. 1954). Jednou z hlavních charakteristik SEM je oproti optickému mikroskopu velká hloubka ostrosti, která je 100 – 500 krát větší než u optických mikroskopů. Právě tato charakteristika umožňuje SEM dobře vykreslit relativně hrubý povrch i při velkém zvětšení. SEM je také parfokální, můžeme fokusovat optiku na zvětšení o vyšší hodnotě, než potřebujeme k práci, pak lze zvětšení snížit bez ztráty ostrosti (Bullivant S. 2009). U tohoto druhu elektronové mikroskopie (SEM) vzniká dojem tzv. reliéfu, který vzniká různou intenzitou vyrážení sekundárních elektronů a také tím, že elektrony z méně přikloněných ploch reliéfu dopadají na 15
detektor s menší pravděpodobností než elektrony z ploch přikloněných k detektoru.
Další
častou
vadou
snímků
pořízených
v
SEM
je
přesvětlení některých jeho částí snímku a to nejvíce na hranách a ostrých výčnělcích preparátu. Hranový jev je způsoben tím, že se elektrony
po
dopadu
primárního
svazku
z těchto
hran
uvolňují
s menším odporem než jinde. (Židek O. 2011). 2.1.2.1.1. Části a stavba elektronového mikroskopu SEM Jedná se o soustavu elektromagnetických čoček (2 kondenzorové, 1 objektivová), vychylovacích cívek a elektrod (fokusační elektroda = Wehneltův válec), které fokusují paprsek na preparát. Dále je to elektronové dělo, které bývá různé konstrukce. Nejčastějším typem je wolframové vlákno, užívá se také vyleptaný hrot z boridu lanthanu (LaB6), nebo Schottkyho katoda (FEG Field emission gun) (Buršík J. 2012).
Obrázek 2: Schéma skenovacího elektronového mikroskopu (Bullivant S. 2009.) V následující tabulce je vidět porovnání některých parametrů jednotlivých elektronových zdrojů (Buršík J. 2012).
Pracovní teplota Jas Energetický rozptyl
jednotka Wolframové vlákno K 2700 A/m2sr 109
1700 5.1010
Schottkyho katoda 300 1013
eV
1,5
0,3
3
16
LaB6
Další
velmi
důležitou
částí
elektron-optických
přístrojů
je
stigmátor, který slouží ke korekci astigmatismu elektronových čoček (Nebesářová J.2001). Ve spodní části elektronového mikroskopu se nachází komora preparátu, která bývá mnohem větší než komora u TEM. V ní je umístěn goniometrický stoleček do kterého se upevňují držáky preparátu, tzv. „stub“. Detektorem
různých
signálů
může
být
scintilační
detektor
s fotonásobičem, polovodičový detektor a další. Žádný elektronový mikroskop se neobejde bez vývěv. Základními typy vývěv jsou rotační, turbomolekulární a iontová vývěva, které zajišťují potřebné vakuum 10-3 Pa a nižší. (Mira 3 FEG-SEM). 2.1.2.2.
Transmisní elektronová mikroskopie TEM
Transmisní elektronové mikroskopy stojí na počátku elektronové mikroskopie, protože první elektronový mikroskop byl TEM. Transmisní elektronové mikroskopii se též říká prozařovací. TEM je složité technické zařízení, které dokáže pozorovat preparát do tloušťky 500 nm při velkém zvětšení a s velikou rozlišovací schopností (Nebesářová J. 2001). Jak už název napovídá, tentokrát se nebudou detekovat elektrony sekundární a ani se nebude po preparátu řádkovat v přesné stopě, naopak, preparát se celý prozáří tokem elektronů. Následně se detekují prošlé elektrony na fluorescenčním stínítku nebo na CCD kameře. Elektronové dělo uvolní elektrony, které letí směrem k preparátu. Po celou dobu svého letu se opět musí pohybovat ve vakuu. Směrem k preparátu je urychluje urychlovací napětí, které mívá obvykle hodnoty mezi 80 kV – 200 kV (Buršík J. 2012). Byla používána i větší urychlovací napětí (až 3 MV), ale momentálně se používá jen několik mikroskopů v Japonsku a USA, 17
jejichž urychlovací napětí dosahuje 1-2 MV. Naopak nedávno vyvinuté korektory sférické vady magnetických čoček zvýšily zájem o urychlovací napětí, jehož hodnota se pohybuje pod 100 kV. Dochází při něm k nižšímu radiačnímu poškození vzorků (Karlík M. 2011). Letící
elektrony
letí
různými
směry
k preparátu,
elektrony
vychýlené z původního směru jsou zachyceny clonou, aby nezkreslovaly obraz.
Prošlé
elektrony
nesou
informaci
o
struktuře preparátu.
Pozorujeme obraz vnitřní struktury preparátu přenesený do plochy. Omezení tloušťky preparátu (500 nm) je nutné, aby elektrony prošly preparátem a nebyly v něm zcela pohlceny. 2.1.2.2.1. Části a stavba elektronového mikroskopu TEM Typicky je to zdroj elektronů, wolframové vlákno apod. dále je to také fokusační elektroda (Wehneltův válec), která má za úkol křížit elektronový
svazek
těsně
před
anodou.
Další
součástí
jsou
elektromagnetické čočky napájené stejnosměrným proudem (fungují pouze jako optické spojky). Dále jsou to části na opravu astigmatismu. Stavba transmisního mikroskopu je hodně podobná stavbě mikroskopu rastrovacího, ale několik zásadních věcí je jinak, jak je možné vidět na obrázku 3.
Obrázek 3: Stavba a řez TEM (www.aldebaran.cz/bulletin/2012_32_mic.php) 18
2.1.2.3.
Skenovací transmisní elektronová mikroskopie STEM
Skenovací transmisní mikroskop STEM navrhl M. von Ardene roku 1938. V tomto návrhu popsal přístroj, ve kterém fokusovaný proud elektronů skenuje skrz preparát v X-Y rastru a elektrony, které proniknou preparátem a jsou zachyceny na fotografickém papíru. Moderní verze STEM byla navrhnuta později roku 1963 (Crewe), praktická forma STEM byla popsána stejným autorem dokonce ještě o tři roky později. Opět předpokládáme elektronový zdroj a systém elektrod, které mohou urychlit elektrony na potřebnou energii, tentokráte se bude napětí pohybovat mezi 100V až několika sty tisíci voltů. Tento tok elektronů je pak fokusován v rovině preparátu za pomoci jedné nebo více elektronových čoček. Sadu vychylovacích cívek nebo elektrod můžeme použít ke skenování fokusovanou sondou v pravoúhlém X-Y rastru, zatímco detekované elektrony mohou být shromážděny a jejich intenzita (proud) vynesena jako funkce pozice sondy tvořící obraz. Zvětšení je pak poměr dvou skenovacích amplitud, zatímco rozlišení je určeno především velikostí fokusu sondy. Kontrast obrázku závisí na výběru elektronů, které detekujeme. (Bullivant S. 2009). Registruje se buď intenzita primárního svazku elektronů (metoda BF-bright
field),
nebo
elektronů
difraktovaných
na
prstencovém
detektoru (ADF- annular dark field), nebo elektronů vychýlených o velké úhly (HAADF- high angle annular dark field) (Karlík M. 2011). 2.1.2.3.1. Části a stavba mikroskopu STEM Elektrony jsou opět uvolňovány elektronový dělem a jsou definovány letem skrz aperturu nebo jiné omezení, což má za následek nastavení tzv. půl-úhlu α v ohnisku. Je to geometrický úhel, který je možno získat jen za užití té nejlepší optiky. Elektronový zdroj musí zajistit dostatečný počet elektronů. V mikroskopii STEM se používají dva druhy zdrojů, které tuto podmínku splňují: je to CFE (the cold field emitter source) a TFE (the thermally asisted field emiter source). Elektrony po průletu 19
clonou letí dál k preparátu. Elektromagnetickými čočkami je tok elektronů fokusován na preparát a fokusovací sonda skenuje skrz preparát ve dvoudimenzionální stopě. Zdroj Dělo Apertura
Čočky a skenovací cívky Preparát Detektory Obrázek 4: Schéma mikroskopu STEM (Bullivant S. 2009) Velikost skenovací sondy (stopy) se pohybuje okolo 0,05 nm (Reimer L. 1985). 2.1.2.4. Nízkonapěťová elektronová mikroskopie (LVEM – Low voltage electron microscopy) Nízkonapěťová elektronová mikroskopie je kombinací TEM, SEM a STEM do jednoho
nástroje, který pracuje při relativně nízkém
urychlovacím napětí 5 kV. Díky nízkému napětí dochází k menšímu poškození preparátu a zvyšuje se kontrast obrazu, což je velmi důležité při biologických pozorováních. Vzorky musí být tenké tzv. nanořezy, obecně tenčí než pro TEM (Nebesářevá J. 2007). 2.1.3.
Interakce elektronů s preparátem, vznik signálů
V této podkapitole se budeme zabývat signály, které vzniknou při interakci elektronů s preparátem v komoře elektronového mikroskopu. Též ukážeme, jak se jednotlivé signály detekují, popřípadě podkladem k jaké informaci jsou. Nejdříve si však řekneme něco o elektronu a jeho vlastnostech.
20
2.1.3.1.
Elektron
Elektron patří mezi leptony, částice, které nejsou schopné silné interakce, ale pouze slabé a elektromagnetické interakce (Anastopoulos C. 2008). Přehled nejdůležitějších konstant platících pro elektron je vidět v následující tabulce (D. Halliday a kol. 2000). Tabulka 1: Konstanty elektronu Hmotnost Spin -31 elektron 9,11.10 kg 1/2
2.1.3.2.
Magnetický moment 9,28.10-24 J.T-1
Náboj -1,602.10-19C
Signály vznikající při interakci elektronů s preparátem.
Pružný rozptyl – letící elektron, který míjí jádro atomu, se vychýlí tím víc, čím blíže jádru prolétává. Kinetická energie a rychlost elektronu se nemění, protože elektron má mnohem menší hmotnost než jádro atomu. Následkem pružného rozptylu vznikají v elektronové mikroskopii zpětně odražené (back-scattered) elektrony.
Obrázek 5: Interakce elektronů s hmotou a vznik některých signálů (Židek O. 2011) Nepružný rozptyl – je to druhý případ, který může nastat, když elektron prolétává atomy preparátu. Tentokráte se srazí urychlené elektrony s elektrony v preparátu. Urychlené elektrony ztratí tímto velkou část své energie, avšak úhel, o který se vychýlily oproti původní dráze letu, je minimální. Následkem nepružného rozptylu vznikají sekundární elektrony, katodoluminiscence, charakteristické rentgenové 21
záření, Augerovy elektrony, též díky němu dochází k vzniku tepla (Kalina T. 1979). Interakce elektronů s preparátem může přinést různé informace. Například o složení preparátu, o topografii, o krystalografii, elektrickém poli a o lokálním magnetickém poli. Oblast interakce vzorku a elektronů se nazývá interakční objem. Velikost interakčního objemu je dána právě ztrátou energie elektronů při nepružném rozptylu anebo zpětným rozptylem při pružném rozptylu. Dále závisí na atomovém čísle prvků zkoumaného materiálu. Zpětně odražené elektrony (BSE) – jedná se o elektrony, jejichž trajektorie byla změněna coulombovskou interakcí s atomy ve vzorku, až se otočily a vyletěly z povrchu vzorku s poměrně velikou rychlostí. Počet elektronů, které se takto zpětně odrazí, závisí na atomovém čísle atomů
ve
vzorku.
Umístěním
detektoru
BSE
pod
objektivem
mikroskopu a rastrováním paprsku přes povrch preparátu je pak možné vytvořit mapu zobrazující oblasti vzorku, které mají různé průměrné atomové číslo jako různé odstíny šedi. Sekundární elektrony (SE) – jsou to elektrony, které vznikají díky nepružnému rozptylu. Elektrony v atomu vzorku získají dostatek energie, aby se z něho uvolnily. Mají velmi nízkou energii (50 eV), takže se sotva uvolní ze vzorku a pohybují se v jeho těsné blízkosti. Právě díky této vlastnosti mohou sekundární elektrony být použity k tvorbě obrázků s vysokým rozlišením. Katodoluminiscence – Některé izolátory a polovodiče produkují UV záření
(včetně
viditelného
světla),
když
jsou
bombardovány
elektronovým paprskem, vzhledem k excitaci a rozpadu párů elektrondíra párů v cílovém atomu. Barva a intenzita tohoto záření je velmi závislá na obsahu stopových prvků a mřížkových poruchách. Rastrovací mikroskop se speciálním optickým detektorem může zkoumat za pomoci katodoluminiscence vnitřní strukturu polovodičů, hornin a skla.
22
Augerovy elektrony – Dopadající elektronový svazek může vyrazit elektron z vnitřních vrstev elektronového obalu atomu vzorku, v této vrstvě pak vznikne neobsazená energetická hladina, tu zaplní elektron z vnější vrstvy elektronového obalu atomu vzorku. Takto uvolněná energie pak může být předána jako kinetická energie jinému elektronu z vnějšího elektronového obalu, který pak opustí atom. Charakteristické rentgenové záření – Jedná se o podobný případ jako u Augerových elektronů. Tentokrát se však excitační energie nepředá jako kinetická energie elektronu, ale vyzáří se v podobě fotonu (char. rentgenové záření). Právě na základě spektra charakteristického rentgenova záření se provádí chemická analýza prvků ve vzorku. Jedná se buď o detektor EDS (EDX = energy dispersive X-ray), kdy se rozkládá rentgenovo záření podle energie nebo detektor WDS (WDX = wavelenght energy dispersive X-ray), kdy se rozkládá podle vlnové délky. Při detekci EDS se načítá celé energetické spektrum a analýzou jeho energie jsou stanovena hmotnostní procenta pro jednotlivé prvky (Židek O. 2011). Teplo – Dopadající elektrony rozechvějí krystalickou mřížku vzorku. Teplo může způsobit škody ve vzorcích obsahujících například těkavé látky a u vzorku s nízkou teplotou tání. 2.1.4.
Rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu
Rozlišovací schopností rozumíme nejmenší vzdálenost dvou bodů obrazu, které ještě rozeznáme jako oddělené (pro oko je tato hranice 0,2 mm ze vzdálenosti 25 cm). Když přibližujeme dva body, jsme schopni je od sebe rozeznat do chvíle, než střed jednoho splyne s minimem druhého, to odpovídá poklesu intenzity zhruba o 19%. Vzdálenost mezi těmito středy popsal Abbe takto: d=
0,66 ⋅ λ n ⋅ sin α 0
(2)
kde λ je vlnová délka elektromagnetického záření, n je index lomu a α0 je úhlová apertura objektivu. Když dosadíme za součin n.sin α0 jedničku potom je ze vztahu vidět, že mezní rozlišovací schopnost je 23
zhruba polovinou vlnové délky dopadajícího záření. Je tedy jasné, že pokud chceme větší rozlišovací schopnost, musíme použít vlnění s menší vlnovou délkou (Nebesářová J. 2001). 2.1.4.1.
Vady elektronového mikroskopu
Abbeho rovnice platí také v elektronové mikroskopii, avšak vlnová délka elektronů je mnohem menší než vlnová délka viditelného světla. Rozlišení elektronových mikroskopů by se pak pohybovalo někde v řádu pikometrů (vzorec 2). Realita je ale jiná, a je to díky optickým aberacím elektronového mikroskopu, které rozlišení ovlivňují. Tři základní aberace el. mikroskopů jsou: Sférická vada – je vadou čočky. Záření neprochází celou čočkou, ale jen jejím středem, některé záření projde dál od středu. Takto prošlé záření se pak soustředí v jiném obrazovém bodě než záření, které vyšlo ze stejného bodu, ale prošlo středem čočky. Pak se bod objektu v obraze neznázorní jako bod, ale jako kotouč. Sférická vada roste se třetí mocninou poloviční úhlové apertury. Tato vada se dá korigovat tím, že bude čočka tvořena silným magnetickým polem a za použití clony. Chromatická vada – každý elektron může mít na počátku různou rychlost (u světelného mikroskopu různé vlnové délky světla) v obraze opět nevznikne přesně bod, ale kroužek. Vlnová délka je funkcí urychlovacího napětí, proto každá jeho změna vyvolá chromatickou vadu. Třetí možností, jak může k této vadě dojít, je ztráta rychlosti elektronů při srážce s předmětem. Lze ji částečně odstranit zmenšením koherentnosti a zlepšením monochromatičnosti svazku (Bystrický V. 1962). Osový astigmatismus – je způsoben asymetrií magnetického pole a nečistotami. Výše zmíněné skutečnosti mají za důsledek to, že elektronové paprsky mají různá ohniska. Korekce se děje magnetickým polem tzv. stigmátorů (vnější přídavné magnetické pole určeného směru). Tato korekce je nezbytná, v SEM se dělá i několikrát denně.
24
2.1.4.2.
Vliv urychlovacího napětí
Urychlovací napětí je jedním z nejzákladnějších specifik elektronových mikroskopů,
udílí
elektronům
energii,
potažmo
vlnovou
délku
v konečném důsledku má veliký vliv na kvalitu výsledného snímku. Elektron je urychlován mezi elektrodami elektrickým polem. Toto pole je tvořeno rozdílným potenciálem katody a anody. Ze zákona zachování energie plyne, že porovnáním kinetické a potenciální energie elektronu v elektrickém poli získáme jeho rychlost. Potenciální energie elektronu spočteme jako E P = U ⋅ e a kinetickou energii elektronu potom jako
Ek =
1 m ⋅ v2 2 . Dáme-li pravé strany obou
rovnic do rovnosti, dostaneme potom hledaný vztah pro rychlost elektronu (3),
v=
2U ⋅ e m
(3)
kde m je hmotnost elektronu, U je rozdíl potenciálu na katodě a na anodě a e je náboj elektronu. Pro hledání vlnové délky elektronů urychlených urychlovacím napětím na rychlost vyjádřenou rovnicí (3) nám bude stačit spojit tuto rovnicí s rovnicí (1). Vlnová délka elektronů (4)
λ=
h
2U ⋅ e ⋅ m
(4)
Vztahy pro potenciální a kinetickou energii a vztahy (3), (4) platí stoprocentně pro elektrony urychlené urychlovacím napětím do 100kV, při užití vyšších urychlovacích napětí se už dostáváme do relativistické fyziky, kde jsou tyto vzorce bez patřičných korekcí neplatné. Platí: E k = mc 2 − m0 c 2
25
(5)
Ek =
m0 2
1−
v c2
c 2 − m0 c 2 (6)
kde m je relativistická hmotnost, m0 je klidová hmotnost. Relativistickou hmotnost lze vyjádřit (7). m=
Ek + m0 c2
(7)
Relativistickou rychlost elektronu lze vyjádřit ze vztahu (5). Rychlost elektronu urychleného napětím větším než 100 kV (8) m0 c 2 v = c 1 − 2 E k + m0 c
2
(8)
Dosazením rovnic (7) a (8) do de Broglieho rovnice (4), E p na místo E k získáme relativistický výpočet pro vlnovou délku urychleného elektronu (9)
λrel =
h eU 2Uem0 1 + 2 2 m0 c
(9)
V následujících dvou tabulkách je srovnání urychlovacích napětí SEM a TEM a jim odpovídající vlnové délky letících elektronů (Židek O. 2011). Tabulka 2: SEM urychlovací napětí U (kV) 0,15 0,25 0,5 1 5 10 15 25 30 λ (pm) 100,15 77,58 54,86 38,79 17,35 12,27 10,02 7,76 7,08 λrel (pm) 100,15 77,57 54,84 38,77 17,31 12,21 9,94 7,66 6,98 v. 10 8 0,07 0,09 0,13 0,19 0,42 0,59 0,73 0,94 1,03 (m.s-1) Tabulka 3: TEM urychlovací napětí U (kV) 80 90 100 110 λ (pm) λ (pm) v. 10 8 (m.s-1)
120
200
4,34 4,09 3,88 3,70 3.54 2,74 4,18 3,92 3,70 3,51 3,35 2,51 1,68 1,78 1,88 1,97 2,05 2,65 26
500
1000
3000
2,73 2,42 -
1,23 0,87 -
0,71 0,36 -
2.1.5.
Příprava preparátů pro elektronovou mikroskopii
Preparáty pro elektronovou mikroskopii se z hlediska užitého záření a vysokého vakua nepřipravují stejně jako preparáty pro mikroskopii světelnou. Příprava preparátů pro elektronové mikroskopy by se dala dělit podle několika kritérií. Prvním z nich je příprava preparátů pro SEM a pro TEM, která je velmi odlišná. Pak můžeme dělit přípravu preparátů podle postupu, který jsme užili na chemickou a fyzikální přípravu. Kritériem může být příprava biologických preparátů oproti přípravě
preparátů
anorganických.
Právě
přípravě
biologických
preparátů se více budeme věnovat v kapitole 2.3. 2.1.5.1.
Příprava preparátů pro SEM vs. TEM
Už z hlediska fyzikálních zákonů a konstrukce jednotlivých mikroskopů je jasné, že preparáty v SEM budou upravovány jinak, než preparáty v TEM. Je to podmíněno i tím, jaké signály jednotlivé mikroskopy detekují. U transmisní elektronové mikroskopie jsou to především prošlé elektrony a skenovací jsou to sekundární elektrony, zpětně odražené elektrony apod. 2.1.5.1.1. Příprava preparátů pro TEM Transmisní mikroskopie má několik nároků na preparáty. Jedním z nich je, aby neobsahovaly žádnou vodu a to z toho důvodu, že se zde pracuje ve vysokém vakuu a voda by se ihned odpařila a preparáty by byly zničeny. Druhým nárokem je velmi malá tloušťka preparátu. Při TEM se používají obrovská urychlovací napětí (o řád až o dva vyšší než u SEM) což by ještě nemuselo zajistit dostatek prošlých elektronů, tudíž kvalitní signál, a proto se do komory TEM vkládají preparáty o maximální tloušťce 100nm. Tyto tenké preparáty se ještě umisťují na clonky z chemicky velmi odolného materiálu (např: 30 % Pt nebo 70 %Au) nebo na síťky z mědi či niklu. Tyto síťky jsou vyrobeny z elektrolýzou (nebo ultrazvukem) vyčištěného drátěného pletiva (Nebesářová J. 2001). 27
Tyto síťky mívají průměr do 3 mm a mohou mít různě hustou síť okének. Opět velikost těchto okének by měla zajistit, aby se elektrony v síťce nepohltily a nebyla tak snížena kvalita obrazu, ale zároveň by měla hustota síťky dokázat udržet tenký preparát stabilní. Na tyto síťky se většinou dávají ještě tenké fólie vyrobené z uhlíku a jsou na ně kladeny tři základní požadavky: neabsorbovat tok elektronů, být mechanicky stabilní a nepoškozovat se tokem elektronů. V transmisní elektronové mikroskopii lze při pozorování vzorku postupovat dvojím způsobem. Buď pozorovat nanořezy dokonale zbavené vody a druhý způsob je pozorovat repliku preparátu, nikoliv samotný preparát (Nebesářová J. 2001). 2.1.5.1.2. Příprava preparátů pro SEM Stejně jako u TEM se i zde musí preparát, obzvláště pak biologický, který obsahuje hodně vody, upravit. Preparát by měl opět splňovat určité požadavky: měl by být stabilní ve vakuu a měl by poskytovat dostatek
požadovaného
signálu,
což
jsou
například
sekundární
elektrony apod. Některé odolné biologické vzorky (málo vody, pevné povrchové struktury) lze pro pozorování v elektronovém mikroskopu opatřit tenkou vrstvou kovu nebo uhlíku (vodivý materiál), který by odváděl náboj a nedocházelo tak k nabíjení preparátu, což vede přímo k znehodnocení snímku. Preparáty se pokovují většinou několikananometrovou vrstvou zlata, platiny, mědi či chromu anebo se pokrývají uhlíkem. Pokovuje se třemi způsoby: vakuové napařování – ve vysokém vakuu se zahřeje kov, kterým chceme pokovit preparát, na takovou teplotu, až se z jeho povrchu začnou odpařovat molekuly, které pak dopadají na chladnější preparát a na něm kondenzují. Rovnoměrnost tohoto naprášení je zajištěna rotačním stolkem, na kterém je preparát umístěn. iontové naprašování – provádí se za pomoci iontů vzniklých při ionizaci plynu. Elektrony jsou přitahovány k anodě, kde se sráží 28
s požadovaným kovem a vyráží z něho částice, které se pak znovu sráží s ionty kovu a vznikne tak mrak, který dokonale obalí preparát. Vrstva by měla dostačovat k odvádění náboje, neměla by však překrýt povrchové struktury. impregnace – kov se na preparát nanese chemickou cestou. Nejčastěji za pomoci kyseliny tanové (TAO) a osmia (Nebesářová J. 2001). 2.1.5.2.
Fyzikální a chemická cesta přípravy
Některé preparáty je lepší připravovat fyzikální cestou, jiné potom cestou chemickou, jde i o to, v jakém stavu nebo jak chceme preparát pozorovat. Preparáty, které nestačí pokovit, musí projít chemickou cestou přípravy. 2.1.5.2.1. Příprava preparátů fyzikální cestou Nejčastějšími způsoby přípravy preparátů touto cestou jsou změna teploty nebo vliv záření. V současné době se hodně uplatňují mrazové metody u biologických preparátů, protože je tak lze pozorovat téměř v nativním stavu bez přídavku jiných látek. Při zmrazování biologických preparátů musíme myslet na to, že se v buňkách nachází voda, která má určité charakteristické vlastnosti: ve zmrzlém stavu zabírá větší objem, má vysoký bod varu a tání. Pří zmrazování preparátů vznikají krystalky ledu, které by preparát znehodnotily, proto tomuto vzniku musíme zabránit. Při krystalizaci ve vodných roztocích dochází k fázové separaci, kdy krystaly stahují vodu z okolních oblastí, a tak se v okolí zvyšuje koncentrace
ostatních
látek.
Fázová
separace
mění
hodnoty
osmotického gradientu a pH, které vedou k destrukci membrán. Tomuto se dá předejít, ošetříme-li vzorek před zmrazením kryptotektantem, což je látka snižující obsah vody v buňce a zvyšující rekrystalizační teplotu (Nebesářová J. 2001). Jednou z dalších metod fyzikální přípravy preparátu pro elektronovou mikroskopii je využití mikrovln. Při ozáření vzorku mikrovlnami dojde ke zvýšení jeho teploty a zlepšení penetrace 29
roztoku, ve kterém je preparát umístěn. Nejčastěji se mikrovlny používají při fixaci preparátu, někdy při imunoznačení mohou být dokonce hlavním fixačním činidlem, jedná se pak o mikrovlnou stabilizaci (Židek O. 2011). 2.1.5.2.2. Příprava preparátů chemickou cestou Chemická příprava preparátů pro elektronovou mikroskopii by se dala rozdělit na několik částí: Fixace preparátu – cílem této fixace by mělo být zachovat preparát tak, aby nepodléhal degradaci a držel se ve stavu co nejvíce podobném stavu nativnímu. Většinou se užívají chemické látky, které preparát imobilizují bez větších strukturálních změn. Tyto látky se pak dělí na aditivní a neaditivní. Aditivní látky nemají koagulační schopnosti a přeměňují cytoplazmu na gel transparentní pro elektrony. Neaditivní látky mající koagulační schopnosti pak denaturují proteiny. V praxi se pak užívají častěji aditivní činidla, která se dělí na aldehydy a oxidační činidla. Aldehydy se vyznačují přítomností aldehydické skupiny –CHO ve své molekule a reagují hlavně s aminoskupinami aminokyselin za vzniku tzv. Schiffových bází. Při fixaci aldehydu si buňky zachovají svou enzymatickou a imunologickou aktivitu, tudíž z nich lze lokalizovat příslušné
enzymy
a
proteiny.
V současné
době
jsou
to
nejvíce
formaldehyd a glutaraldehyd. Druhou skupinou jsou oxidační činidla, z nichž se nejvíc používá oxid osmičelý a oxid ruteničelý. Všechna fixační činidla, vyjma manganistanu draselného se používají rozpuštěná v pufrech. Důvodem je, aby se fixační roztok co nejvíce svými vlastnostmi blížil prostředí, ve kterém byl preparát před odebráním. Na vlastnosti pufrů jsou v elektronové mikroskopii kladeny veliké nároky. Měly by mít dostatečnou tlumící kapacitu, chemickou stabilitu a odolnost vůči degradaci enzymy, neměly by disociovat a uvolňovat ionty vápníku a draslíku. Ve skutečnosti je skoro nemožné tyto všechny podmínky splnit, proto se jim roztoky snaží aspoň přiblížit a v dnešní době se tak nejvíce používá fosfátový a kakodylátový pufr (Nebesářová J. 2001). 30
Dehydratace preparátu – umístění preparátu do roztoku alkoholu s rostoucím podílem dehydratačního činidla, čeká se, až úplně nahradí vodu v preparátu. V současné době se nejvíce používá ethanol a aceton. Zalévání preparátu – provádí se zejména proto, aby mohl být preparát nakrájen na ultratenké řezy (platí pro TEM). Preparáty se zalévají pryskyřicí, na kterou jsou kladeny opět veliké nároky. Pryskyřice by měla být odolná vysokému vakuu a při toku elektronů nepoškoditelná, zároveň by ale neměla moc rozptylovat elektrony a poškozovat tak obraz. V současné době se nejvíc používají epoxidové, akrylátové a polyesterové pryskyřice. Zalévání se děje nejčastěji dvěma způsoby, buď plošně pro případ, kdy je potřeba preparát orientovat co nejblíže řezné rovině, anebo do kapslí, ve chvíli kdy nezáleží na orientaci preparátu (Nebesářová J. 2001). Polymerizace zalévacího média – startuje se teplem při teplotě zhruba 60 °C, UV zářením anebo přidáním chemického katalyzátoru nebo iniciátoru polymerizace. Řezání preparátu – U TEM je to poslední krok přípravy před tím, než se vloží preparát do komory mikroskopu. Řezání se děje na tzv. ultramikrotomech,
přístrojích
schopných
řezat
ultratenké
vrstvy,
používajících k postupu vzorku k noži buď tepelnou dilataci anebo mechanický posuv. Vzorek zalitý do pryskyřice má skoro stejnou hustotu jako samotná zalévací hmota a to snižuje kontrast výsledného obrazu, ten se pak zvyšuje několika způsoby např. kontrastování preparátu sloučeninami těžkých kovů (octan uranylu). Jedná se o absorbci těžkých kovů na buněčné organely, protože těžké kovy více rozptylují elektrony a zvyšují tak kontrast biostruktur (Nebesářová J. 2001).
31
2.2. Membránové struktury 2.2.1.
Bilogická membrána
Biologickou membránou rozumíme membránu ohraničující buňku, a to jak prokaryotickou tak eukaryotickou. U eukaryotické buňky se vyvinuly i membrány ohraničující určité organely. Jsou to např.: lysosómy, mitochondriální membrána, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, jádro, u rostlin se též vyvinula membrána chloroplastů. Biologické membrány tvoří fázové rozhraní, oddělují dva různé prostory. Umožňuji vznik kompartmentů s různým chemickým složením a různými fyzikálními vlastnostmi (Kodíček 2000). Membrány nejsou jen jakousi vnitřní bariérou, ale hrají hlavní roli v životě buňky. Kontrolují pohyb látek do buňky a z buňky dále kontrolují tok informací mezi buňkami, buď za pomoci rozpoznávání signálních molekul nebo vysíláním chemického či elektrického signálu ostatním buňkám (Brown B. 1996).
Obrázek 6 Řez buňkou: Na obrázku jsou jednotlivé buněčné organely, buněčná stěna a plazmatická membrána. Levá půlka je buňka rostlinná, pravá půlka je buňka živočišná. (http://classes.midlandstech.edu) Další funkce membránových struktur jsou velmi rozmanité, např.: syntéza proteinů, zásobní vezikuly, vylévání látek z buňky exocytózou a
32
naopak přijímání látek do buňky endocytózou, syntéza přenašeče ATP v mitochondriích, transport látek v rámci buňky (Vácha M. 2008). 2.2.2.
Struktura biologických membrán
Před více než čtyřiceti lety byly biologické membrány popsány jako dvoudimenzionální tekutiny složené ze dvou vrstev, které obsahovaly převážně lipidy. Tento model tekuté mozaiky stále nejlépe popisuje biologické membrány (Singer S. 1972). Biologické membrány jsou tvořeny ze tří hlavních komponent: jsou to lipidy, proteiny a cukry. Všechny biologické membrány mají stejnou základní strukturu, ve které mají dvouvrstevné listy lipidů v sobě zabudovány proteiny (obr. 7). Tato struktura je vysoce tekutá a mnohé z lipidových a proteinových molekul se mohou pohybovat v rovině membrány. Lipidové a proteinové molekuly
jsou
spojeny
nekovalentní
vazbou,
kdežto
cukry
jsou
připojeny kovalentní vazbou na molekulu lipidu nebo proteinu a vyskytují se pouze na jedné straně membrány např.: na vnějším povrchu plazmatické membrány (Brown B. 1996).
Obrázek 7 Struktura biologické membrány: Fosfolipidová dvojvrstva proteiny a cholesteroly (Brown B. 1996) Biologické membrány bývají široké 3 – 6 nm. Buňka je otevřený systém, který neustále komunikuje s okolím výměnou informací, látek a energie, pak je tedy jasné, že membrána svou nepropustnost musí
33
kompenzovat nějakými složitými mechanismy, které dovolují řízeně přenášet látky a informační signály (Kodíček 2000). 2.2.2.1.
Lipidová dvojvrstva
Lipidovou dvojvrstvu lze chápat jako dvojrozměrnou kapalinu, v níž za fyziologických teplot nemají lipidy svá pevná místa, naopak mohou se ve své vrstvě plně pohybovat. Rychlost tohoto (difuzního) pohybu je obrovská, udává se, že jednotlivý lipid si se svým sousedem vymění místo 107 krát za sekundu (Kodíček 2000). Lipidy nejsou rozpustné ve vodě, ale jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, jako je například aceton (Brown B. 1996). Biologické membrány tvoří tří základní typy lipidů: fosfolipidy, glykolipidy a cholesteroly, přičemž v membráně každý z nich plní svou specifickou funkci. Fosfolipidy - nejběžnější typy fosfolipidů jsou tvořeny glycerolem spojeným se dvěma řetězci mastných kyselin, fosfátem a cholinem. Řetězce mastných kyselin obsahují mezi 14 a 24 atomy uhlíku. Jeden řetězec bývá z pravidla nenasycený a obsahuje jednu až čtyři cis dvojné vazby. Protože ty lipidy obsahují glycerol, nazývají se glycerofosfolipidy. Tři
základní
typy
(HOCH2CH2N+(CH3)3)
glycerofosfolipidů
nebo
obsahují
cholin
(HOCH2CH(COO-)NH3+)
serin
nebo
ethanolamin (HOCH2CH2NH3+) připojený k fosfátu. Glykolipidy
–
ve
spojení
s fosfolipidy
obsahují
molekuly
glykolipidu buď glycerol, nebo sfingosin spojený s řetězcem mastné kyseliny. Liší se pak od fosfolipidů tím, že mají v sobě na místo hlavy fosfátu zabudovaný cukr, jako je například glukóza nebo galaktóza. Glykolipidy
v membránách
zvířecích
buněk
obsahují
téměř
vždy
sfingosin, oproti tomu v membránách bakteriálních buněk a rostlinných buněk je obsažen glycerol. Každopádně, glykolipidy jsou umístěny na vnějším povrchu plazmatické membrány s jejich cukry vystavenými na povrchu buněk.
34
Cholesteroly – jedná se o třetí typ lipidů tvořících membrány. Tyto lipidy jsou strukturálně zcela jiné než glykolipidy a fosfolipidy. Cholesterol obsahuje čtyři struktury steroidu společně s krátkým uhlovodíkovým
postranním
řetězcem
a
hydroxylovou
skupinu.
Cholesterol byl objeven na některých savčích membránách a také na jednom typu mikroorganismu (mykoplazma), obvykle nebývá nalezen na rostlinných membránách ani na membránách bakterií (Brown B. 1996). Společným obecným znakem všech membránových proteinů je jejich amfifilní charakter. To znamená, že proteiny obsahují hydrofilní oblast (polární) a oblast hydrofobní oblast (nepolární). Glykolipidy a fosfolipidy mají každý hydrofilní hlavici a dva hydrofobní řetězce. Při ponoření do vody budou tyto molekuly spontánně tvořit dvojvrstvy, které budou uspořádány tak, že hydrofobní konce budou uzavřené mezi hydrofilními hlavicemi. Hydrofilní hlavice budou pak za pomoci vodíkových můstků a elektrostatických interakcí reagovat s vodou (Brown B. 1996).
Obrázek 8 Liposom v řezu: Voda uzavřená uvnitř liposomu (Brown B. 1996). Podle koncentračních poměrů a typu zúčastněných polárních lipidů a v závislosti na teplotě mohou vznikat různé struktury jako: micely (kulovité útvary), liposomy (obr. 8) a v neposlední řadě pak rozsáhlé rovinné dvojvrstvy, které jsou základem biomembrán. Liposomy takto eliminují kontakt hydrofobního řetězce s vodou a tvoří tak kompartmenty. Liposomy jsou užitečné modely membrán pro 35
výzkum a mohou být použity k doručení léků do jednotlivých orgánů v těle.
Většina
buněk
absorbuje
liposomy
obyčejnou
fúzí
přes
membránu. (Brown B. 1996). Lipidovou dvojvrstvou velmi dobře procházejí hydrofobní molekuly malé velikosti, jako jsou např.: 02, CO2 a malé nenabité polární molekuly: H2O, ethanol. 2.2.2.2.
Membránové proteiny
Bílkoviny v membránách vykonávají specifické biochemické funkce. Proto se
počet bílkovin a
jejich druh liší u různých membrán. Je-li
např. membrána více aktivní v metabolismu, obsahuje více bílkovin. Existuje několik způsobů, jak se spojí bílkoviny s lipidy a vytvoří dvojvrstvu. Mnoho membránových bílkovin prochází, často i několikrát napříč dvojvrstou. Jsou to transmembránové proteiny, které mají hydrofobní oblasti vnořené dovnitř dvojvrstvy a komunikují tak s hydrofobními konci fosfátů. Hydrofilní konce těchto proteinů se pak objevují na obou stranách
membrány.
Některé
transmembránové
proteiny
jsou
kovalentně připojeny na řetězec mastné kyseliny, který je vložen do fosfolipidové dvojvrstvy. Některé intracelulaární bílkoviny nejsou položeny na membráně, ale jsou přichyceny kovalentní vazbou na vnitřní povrch membrány, a to jak na mastné kyseliny, tak na fosfolipidy. Takové proteiny jsou pak označovány jako integrální proteiny, jsou pevně připojeny k membráně a můžou být odstraněny pouze působením detergentů nebo organických rozpouštědel, které naruší membránu. Příklady jsou cholinesteráza, která byla objevena v synapsích a G-protein, který hraje roli v přenosu informace přes membránu. Některé proteiny jsou slabě vázány na jeden z povrchů membrány nekovalentní
interakcí
s jiným
membránovým
proteinem.
Takové
proteiny mohou být odděleny mírným zásahem, a to třeba změnou pH nebo iontové síly. Je to zásah, který nechává membránu neporušenou. Tyto proteiny, jejichž zástupcem může být třeba cytochrom c, který se 36
nachází na vnitřní straně mitochondriální membrány, nazýváme periferní membránové proteiny (Brown B. 1996). Integrální bílkoviny zajišťují specifické funkce membrán, jakožto transport hmoty a i informací přes tuto membránu a transformaci energie prostřednictvím protonmotivní síly. Periferní bílkoviny pak zase vytvářejí v některých často namáhaných membránách podpůrnou dvojrozměrnou síť. Děje se tomu tak v membránách erytrocytu, ale bylo to zjištěno i u nervových buněk. 2.2.3.
Jaderná membrána
Jaderná membrána (nucleolemma, karyotheca) je fyzikální bariéra oddělující jaderný oddíl (DNA) od okolní cytoplazmy. Jaderná membrána se skládá z dvou paralelních membrán oddělených perinukleárním prostorem (20-40nm). Vnější membrána je spojena s membránovým systémem endoplazmatického retikula a perinukleární prostor komunikuje s jeho vnitřním prostorem (Luštinec J. 2003). Vnitřní jaderná membrána je připojena k jaderné lamině (síť intermediálních filament), která funguje jako místo pro připojení chromozomů a poskytuje strukturální stabilitu jádra a také propojuje komplexy jaderných pórů. Jaderný obal je protkán velkým množstvím jaderných pórů, které zabírají až 20% jeho povrchu. Jaderné póry umožňují obousměrný transport makromolekul mezi jádrem a cytoplazmou. Do jádra pomocí nich přichází proteiny určené jádru a z jádra cestují molekuly RNA. Vnitřní a vnější membrána se kolem každého póru spojí a vytvoří tak trubicovitou
stěnu.
Průchodnost
pórů,
které
jsou
tvořeny
multiproteinovými komplexy, je regulována „zátkou“, jejíž funkce je spjata s hydrolýzou ATP. Počet a rozmístění jaderných pórů je různé, závisí na druhu buňky a na metabolismu (Luštinec J. 2003). Podrobnější stavba jaderného póru je vidět na obrázku 9. Funkce samotného jádra je pak trojí. Jádro nese a uchovává genetickou informaci a při buněčném dělení ji předává dceřiným 37
buňkám, v procesu transkripce se zde syntetizuje mRNA, která je pak v cytoplazmě transplatována, jádro slouží jako skladovací a signální kompartment umožňující regulované uvolňování nízkomolekulárních a vysokomolekulárních regulačních faktorů (proteiny, RNA) do cytoplazmy a opačně. Toto uvolňování se děje právě přes jaderné póry, malé molekuly rozpustné ve vodě procházejí neselektivně mezi jádrem a cytoplazmou, makromolekuly pak musí obsahovat třídící signál, kterým je většinou sekvence lysinů.
Obrázek 9: Stavba jaderného póru (http://course1.winona.edu/sberg/ILLUST/nuc-por2b.JPG). 2.2.4. Jedná
Cytoplazmatická membrána se
o
tenký
semipermeabilní
(propustnost
závislá
na
membránovém potenciálu) obal ohraničující vnitřek buňky od vnějšího prostředí a kontrolující pohyb látek do buňky a z buňky. Buněčná membrána hraje roli při kotvení cytoskeletu, dává buňce tvar, má vliv na uchycení buněk k jiným buňkám a pomáhá při formování se do tkání. Jednou z hlavních funkcí této membrány je transport látek do buňky a odstraňování škodlivých látek z buňky ven. Transport látek přes membránu by se dal dělit na pasivní a aktivní. Zástupcem aktivního transportu je třeba endocytóza. Jedná se o děj, kdy buňka absorbuje molekuly jejich pohlcením. Buňka tak 38
pohlcuje například pevné látky, ionty ale i makrokomolekuly. Opakem endocytózy je exostóza, za pomoci níž buňka vypuzuje škodlivé a odpadní látky do extracelulárního prostředí. Sekreční vakuoly se pohybem za pomoci cytoskeletu dostanou k cytoplazmatické membráně, lipidová dvouvrstva se přeskupí a dvě membrány spolu pak navzájem fúzují. Zástupci pasivního transportu látek přes membránu jsou pak osmóza a difúze. Difúze využívají některé malé látky a ionty (CO2, 02). Některé látky se vyskytují v různých koncentracích na obou stranách membrány, koncentrační gradient pak umožňuje osmotický tok vody přes membránu. Některé
látky,
pro
které
je
membrána
nepropustná,
jsou
přenášeny za pomoci integrálních bílkovin nazvaných permeázy. Jejich funkce v membráně je čistě transportní a to hlavně pro ionty (H+, K+, Na+, Cl-) a pro některé nenabité polární látky (glukóza).
2.3. Kryotechniky V této metodě se na místo chemické fixace používá fyzikální fixace zamrazení vzorku. Metody kryofixace mají výhodu v tom, že buňky jsou zamrazovány v nativním stavu. Vyhýbáme se tím vzniku artefaktů vzniklých chemickou fixací. Jsou to například freeze – etching (drying), spray freezing, high pressure freezing. 2.3.1.
Metoda freeze-etching
Vznikají výsledné platino-uhlíkové repliky, které obsahují mnohem více informací o membránách, potažmo celé buňce, než kolik podávají nanořezy (Robinson D.G. 1987). Velkou výhodou metody freeze-echingu je, že ve vzorku lomy postupují podél lomných linií a díky tomu získáváme trojrozměrné obrazy membrán a buněk (Bullivant S. 1973).
39
2.3.1.1.
Historie freeze-etchingu
Roku 1950 Hall sestrojil zařízení, kde mohl ve vakuu pozorovat povrch zmražené vodné suspenze. Byla použita metoda přenosu stínu za nízké teploty,
ale
její
možnosti
při
překonávání
potíží
s dehydratací
v souvislosti s buňkami a tkáněmi nebyly více prozkoumány. Toto bylo nezávisle prozkoumáno Merymanem (1950), který získal dokonalé snímky zmrazených povrchů technikou vypařování SiO (Bachmann L. 1973). Později pak Meryman s Kafigem (1955) použili rafinovanější verzi tohoto zařízení s technikou pro lámání ve vakuu a dělali pokusy se sledováním
biologických
materiálů
za
pomoci
freeze-etchingu
(fracturingu). Roku 1957 Steere vyrábí repliky virů rostlin a stává se prvním pracovníkem, který získává rozpoznatelné repliky za užití této metody. Haggis roku 1961 rozlomil zmrazený erytrocyt ve vakuu a replika ukázala lomovou linii skrz cytoplazmu. Novodobá fáze této techniky začíná až v roce 1961 (Moor et al.) s výrobou moderních přístrojů pro freeze-etching. Používá se na -196 °C chlazený nůž, tenké plátky jsou pak odřezány od zmrazeného vzorku (-100 °C) a na povrchu je následně udělána platino-uhlíková replika. Zjednodušené zařízení pro freeze-fracturing popsal Bullivant společně s Amesem roku 1966 (Bullivant S. 1973). Jejich preparáty byly po zmrazení rozlomeny pod tekutým dusíkem a přesunuty do vakuového odpařovače, který byl pak vypumpován až k odhalení lomených kusů tkání, které byly pak vystínovány platinovo - uhlíkovým filmem. 2.3.2. Prvním
Zmrazování biologického preparátu krokem
metody
freeze-etching
je
zmrazení
biologického
preparátu. Při zamrazování biologického preparátu se musí pracovat velmi opatrně, aby se preparát při vzniku ledových krystalů nepoškodil. Aby se zabránilo tvorbě ledových krystalů, je zamrznutí velmi rychlé a dosáhne se tzv. skelného stavu (vitrifikace). Dosažení vitrifikace lze charakterizovat
takto:
teplo
se
odvádí 40
rychleji,
než
může
být
produkováno za krystalizace. V důsledku toho se ledová centra (místa, kde se krystaly začínají tvořit) nejsou schopna výrazně zvětšovat a díky tomu
se
aspoň
část
kapaliny
dokáže
podchladit
pod
teplotu
rekrystalizace. Rozmezí teplot, kterých je nakonec dosaženo (ledové krystaly a zamrznutí eutektika), stejně jako tempo zmrazení určuje dílčí úspěch při fixaci mrazením. Ledové krystaly se v čisté vodě tvoří mezi teplotami 0 °C a -130 °C. Jsou- li přítomny rozpustné látky tento interval, jde více ke kladným teplotám. V případě cytoplazmy leží tato teplota okolo -20 °C a -80 °C. Tempo zamrazení rozhoduje o tom, kolik a jaké krystaly v buňce vzniknou. Při nízkém tempu zamrazování molekuly rozpuštěných látek stejně jako molekuly vody slouží jako centra pro vznik krystalů. Při vyšším tempu zamrazování se pak stávají těmito centry pouze molekuly vody,
což
má
za
následek
produkci
velkého
množství
malých
homogenních krystalů. Ke změně z heterogenních na homogenní ledové krystaly dochází náhle, když je dosažena a překročena tzv. kritické rychlost mrazení. Tyto hodnoty jsou opět rozdílné pro čistou vodu a pro vodu s rozpuštěnými látkami. Kritická rychlost mrazení pro čistou vodu je 106 °C.s-1 pro cytoplazmu je tato hodnota okolo 104 °C.s-1. Tyto hodnoty platí pouze pro vrstvy tlusté několik mikrometrů a sférické objekty mající až 20 mikrometrů v průměru. Jednou z možností, jak tuto hodnotu snížit, je změnit hodnotu hydrostatického tlaku. Při hodnotě hydrostatického tlaku 200 MPa kritická hodnota mrazení pro vodu klesne na hodnotu 102 °C.s-1Aby se udrželo poškození buňky na minimu, může být takto vysoký tlak použit jen na několik sekund. Jinou možností je potom použití kryoprotektiv (Robinson D.G. 1987).
41
2.3.2.1.
Kryoprotektiva
Kryoprotektiva jsou látky, které podstatně snižují kritickou rychlost mrazení. Například u cytoplazmy se za použití 20% glycerinu sníží tato hodnota na 102 °C.s-1. Kromě toho se v důsledku přítomnosti velkého množství osmoticky aktivních látek sníží bod tuhnutí a zvýší se bod rekrystalizace. Díky tomu se doba, po kterou se mohou tvořit ledové krystaly, značně sníží. Kryoprotektiva se dělí na pronikavá a nepronikavá. Klasickými zástupci první skupiny jsou glycerin a dymethyl sulfoxid (DMSO). Obvykle
se
tyto
látky
zavádí
do
buněk
postupně
v rostoucích
koncentracích. Při práci s těmito látkami je nutno dbát zvýšené opatrnosti
kvůli
v pozorovaném
tomu,
vzorku,
že
mohou
jako
jsou
způsobit například
řadu
artefaktů
„puchýřky“
na
endomembráně nebo segregace membránových proteinů v důsledku přerozdělení membránových lipidů. Nepronikavé polymery jako jsou polyvinyl
pyrrolidin
a
dextran
nemají
mnoho
úspěchů
jako
kryoprotektanty. Bylo ale zjištěno, že jejich použití může vést ke změnám lámavých ploch v membránách (Robinson D.G. 1987). 2.3.3.
Kryogenní mrazící metody
Jako kryogenní látky se mohou používat pouze zkapalněné plyny, které nepodléhají Leidenfrostovu jevu (snižuje se rychlost chlazení v důsledku tvorby tenké plynné vrstvy). Dříve se používal freon 12 (dichlor-difluormethan, bod tání 159°C) freon 22 (monochlor-difluormethan, bod tání -160°C), v dnešní době se nejvíce používá dusík -210°C a pro zvláštní techniky se používá propan (bod tání -187°C). U propanu je třeba poznamenat, že se jedná o výbušnou látku a práce s ním by měla probíhat pouze v digestoři. Je několik metod, jak zamrazit vzorek. Metoda dip, kde je v Dewarově nádobě vložena kovová tyčka, která je z jedné strany dutá. Její horní část dutá není, je zde jen v plné části malá jamka. Celá soustava je chlazena tekutým dusíkem, v jamce dochází ke zkapalnění 42
kryogenu, který velmi rychle tuhne. Pomocí kovové tyčinky dočasně zkapalníme kryogen, ve kterém zamrazujeme vzorky. Před zamrazením jsou vzorky naneseny na terčík, který je uzpůsoben k vytvoření jednoduché repliky nebo dvojité repliky. Pak jsou jednotlivé nebo „sendvičové“ druhy nosiče s preparátem přesunuty za pomoci pinzety do zkapalněného kryogenu na několik sekund. Po zamrazení je pak preparát rychle přesunut do zkapalněného dusíku, ve kterém je uchováván po celou dobu přípravy. Tempo zamrazení se u této metody pohybuje při nejlepším okolo
103°C.s-1 ,ale pro rozsáhlejší typy nosičů
se téměř ihned tvoří ledové krystalky, není-li přítomen kryporotektant. Rychlého promrazení lze dosáhnout pouze užitím „cryojet“ metody. Jedná se o metodu, kdy je plynný kryogen, většinou se jedná o propan, vstřelen za pomoci pistole na stlačený plyn (pracující s N2 plynem, za tlaku 0,4 MPa) na vzorek umístěný v sendvičovém nosiči ležící ve vzdálenosti 1cm. Kryogen může být nanášen z jedné nebo z obou stran. Přístroje a celkové zařízení pro tuto metodu jsou normálně komerčně dostupné, napřiklad od firmy Balzers. Metoda, kdy je suspenze buněk a organel nanesena do kryogenu, se nazývá „spray“ metoda. Opět se tak děje za použití pistole na stlačený plyn, tentokráte je však jejího efektu užito k unášení jemných kapek (až 30 µm v průměru) suspenze směrem na kryogen. Poté, co se vzorek zamrazí, je kryogen odpařen ve vakuu při vyšších teplotách (-85 °C). Pak se přidá po kapkách předem chlazený toluen nebo nbutylbenzen. Toto všechno vytvoří hustou pastu, v níž je zmrazený buněčný materiál. Kapka této buněčné suspenze (-85 °C)se pak přenese za pomoci předem chlazené jehly na terčík. Zmražené vzorky se pak udržují v tekutém dusíku. Všechny tři metody zamrazování jsou shrnuty a popsány na obrázku 10.
43
Obrázek 10: Srovnání tří zamrazovacích metod (Robinson D.G. 1987). 2.3.4.
Fracturing (lámání)
Prvním krokem, který ještě předchází samotnému lámání, je přenesení zamrazeného preparátu do vakua. Například při Bullivant-Amesově metodě je zamrazený vzorek udržován pod tekutým dusíkem a následně je v tomto ponořeném stavu tříštěn za pomoci skalpelu, až pak bývá mosazné lámací zařízení převedeno do odpařovací jednotky. Replikace pak nastává až poté, co je dusík odčerpán pryč. Přístroje na freezeetching sestavené na tomto principu mají tu výhodu, že jsou levné, avšak oproti konvenčním přístrojům je kontrola jednotlivých kroků pracovního postupu zatížena nepřesnostmi. V jiných přístrojích na freeze-etching se štěpení provádí přímo ve vakuu. Tyto stroje mají rotační, olejové nebo turbomolekulární pumpy a jsou vybaveny stolkem pro vzorek a zázemím pro práci s nožem, přičemž oba z nich mohou být chlazeny kapalným dusíkem při neporušení vakua. Aby se snížila možnost tvorby ledových krystalů, musí být vzorek přenesen velmi rychle na předem podchlazený stolek, teplota stolku je volitelná, minimální teplota je pak -150°C. Při té se udrží množství 44
kondenzované vody (přesněji vodní jinovatky) na stolku na minimu a umožňuje to tak dosažení vysokého vakua v kratším čase. Samotné vložení vzorku do vakua pak probíhá za pomoci manipulační tyče, přes přechodovou komoru. Samotný fracturing probíhá pak v pracovní komoře. Jsou dva způsoby, jak můžeme zamražené objekty přenést na stolek. Jednotlivé objekty jsou společně se svým terčíkem přeneseny za pomoci jemné pinzety samostatně a pak jsou našroubovány do polohy s příslušným držákem. V tomto případě je stolek předem podchlazen v kapalném dusíku. Předměty
zamrazené
v sendvičové
formě
jsou
vloženy
do
speciálního držáku replik, který je ponořen do kapalného dusíku. Držák je pak za pomoci manipulační tyče přenesen na podchlazený stolek pro preparát v pracovní komoře. Po přenesení stolku do pracovní komory je hned nastaveno vysoké vakuum (10-5 Pa), kterého musí být dosaženo před tím, než nastane lámání. Záleží na tom, jaký druh nosiče použijeme, jestli připravíme jednoduché nebo dvojité lomové linie. V prvním případě se používá nože a jeho okolního zařízení, které je podchlazeno na -190 °C a je vybaveno jednou řeznou hranou. Aby se zabránilo štípání, nebo dokonce úplné ztrátě vzorku, nedoporučuje se řezání pomalými pohyby. Při správné přípravě mají pak oddělené objekty rovné plochy. Nakonec je nůž buď nastaven nad vzorek, pokud se provádí následně etching a pokud ne, je odstraněn pryč úplně. Práce se sendvičovým stolkem je pak o mnoho jednodušší. Jedná se o uvolnění spony přidržující sendvičový nosič pohromadě, k tomuto otevření dojde buď zcela mechanicky pomocí nože anebo je částečně elektricky aktivováno. Lomné plochy, které vznikají tímto způsobem, jsou komplementární.
45
Pro vytvoření repliky za využití etchingu je potřeba udržet stolek pro vzorky na -100 °C, jestliže následuje přímo napařování, tak je teplota stolku -110 °C. 2.3.4.1.
Lomné plochy biologických materiálů
Zpravidla
lomné
dvojvrstvami
plochy
doslova
biomembrány.
To
běží
mezi
představuje
dvěma
lipidovými
hydrofobní
oblast
membrány, kde jsou mezimolekulární síly mnohem menší než na povrchu membrány.
Obrázek 11: Lomné plochy biologických materiálů (Robinson D.G. 1987). Na obrázku 11 pak můžete vidět, jak tyto lomné plochy mohou vzniknout. Názvy mající na začátku písmeno P označují cytosol nebo stroma plastidů a mitochondrií, názvy s písmenem E na začátku pak označují lumina endomembrán a extracelulárního prostoru. Písmeno M označuje mitochondrii, písmeno V vakuoly. 2.3.5.
Etching (leptání)
Vzhledem k tomu, že lomné linie běží podél lipidových dvojvrstev, skutečný povrch buňky pak zůstává závislý pouze na přípravě freezefracturingu. Aby bylo možné odhalit takové povrchy, musí se odstranit okolní eutektikum, čehož se dosahuje právě leptáním, přičemž se tak stává odhalený skutečný povrch membrány. V metodě freeze-etching následuje po rozlámání (fracturingu) krátké přikrytí preparátu krytem podchlazeným na -100 °C, který slouží 46
k vytvoření
podmínek
vhodných
k etchingu,
jenž
ještě
předchází
samotnému napařování. Tlak par vody se pohybuje při teplotě -100 °C okolo 1.10-5 mm Hg. Ve vakuu zmrazená voda sublimuje z lomné plochy za předpokladu, že parciální tlak vodní páry je menší, než je v rovnováze s ledem. Rychlost sublimace (recese ledu) je za konstantních podmínek vakua velmi závislá na teplotě. Etching je nejvíce kontrolovatelný za teploty -100 °C, kde se může odstranit až 90nm ledu za minutu. V podstatě se dá říci, že při konstantním průběhu etchingu, může být jeho míra změněna faktorem 10, pokud teplota vzorku klesne nebo stoupne o 10 °C. Při -100 °C je hodnota parciálního a nasyceného tlaku vodní páry podobná a možnost sublimace je snížena na minimum. Při nižších teplotách tlak nasycených par výrazně klesá, což způsobuje nevyhnutelně kontaminaci povrchu. Tato kontaminace se dá potírat jen za velmi vysokého vakua, dokonce i při teplotě -100 °C musí být přijata opatření proti desublimaci vody. Děje se tak nožem, jehož teplota je o mnoho nižší (-196 °C) který se přiblíží na dva milimetry ke vzorku a slouží pak jako past pro sublimované páry. 2.3.6.
Stínování a formování repliky
Nejčastěji se zamrazené povrchy vzorku pokrývají směsí uhlíku a platiny, tato vrstva se nanáší pod úhlem 45°. Takovéto stínování vytváří na povrchu lomných linií film, který dosahuje tloušťky 2-5 nm. Tloušťka této vrstvy v jiných místech je přímo závislá na sklonu lomné plochy v tomto bodě, a tudíž topologie povrchu je tak přeměněna na rozdíly v tloušťce tohoto stínování a nakonec i do výsledných snímků pořízených elektronovým mikroskopem. Dříve se velikost zrn směsi platiny s uhlíkem pohybovala okolo 2 nm a byl to tedy limit, který se mohl na replice pozorovat. V dnešní době je velikost zrn menší a citlivost přístrojů větší. Po stínování směsí platiny a uhlíku následuje napaření vrstvy čistého uhlíku (24 nm), aby byla zafixována platina na místě napaření (Bullivant S. 1973).
47
Starší
zařízení
pro
freeze-etching
jsou
vybavena
odporem
odpařování jak pro směs Pt/C tak pro C filmy. Elektrody jsou grafitové tyče, přičemž v místě jejich styku je za pomoci pružin udržován konstantní tlak po celou dobu odpařování. Jedna elektroda každého z párů má zploštělou špičku (2mm v průměru). Elektroda pro Pt/C je tak ostrá, že na jejím hrotu je vytvořen váleček o průměru 1mm. Cívka platinového drátu je pak zatlačena do uhlíkového hrotu. Elektrody jsou uvedeny do vzájemného kontaktu a platinové cívky pečlivě zatlačeny do místa nad spojením obou elektrod. Odpařování se provádí za vysoké hodnoty proudu (50 – 70 A) ale nízkými hodnotami napětí (2 V pro Pt/C odpařování, 8 V pro C/C odpařování). Jednotlivé časy pro odpařování jsou pak 5 s pro Pt/C elektrody a 8 s pro C/C elektrody. Teplo, které vzniká v kontaktu obou elektrod je dostatečné pro odpaření jak platiny, tak uhlíku. Modernější stroje pro freeze-etching jsou vybaveny elektronovými děly. Ty jsou sice dražší, ale až několik odpaření se může provést bez výměny
odpařujících
tyčinek.
V této
metodě
je
žhavena
spirála
(wolfram). Do jejího středu je umístěna uhlíková tyčinka. Spirála je žhavena pomocí vysokého napětí, vzniká tak velké teplo, které vede k odpaření materiálu tyčinky. Výsledné páry uhlíku nebo Pt/C směsi pak prochází Wehneltovým otvorem předtím, než jsou za pomoci vychylovacích destiček směřovány na vzorek. Anoda v Pt/C děle je dutá uhlíková tyčinka, do které je zasunuta platinová vložka. Pokud není narušeno, pak se Pt/C (vydrží 9-11 aplikací při výrobcem doporučeném nastavení)
dělo
nemusí
přestavovat
a
centrovat
před
novým
odpařováním, na rozdíl od C/C (vydrží 3 aplikace při výrobcem doporučeném nastavení děla). Doba odpařování obou výparníků leží mez 4 s – 8 s. 2.3.7.
Čištění repliky
Po dokončení napařovacích aplikací je vzorek za pomoci manipulační tyče vytažen z pracovní komory. Po rozmrazení a zkapalnění zbytku vzorku je replika sejmuta na hladinu čistícího média. V médiu probíhá 48
čištění. Dříve se replika odstraňovala z objektu opatrným vložením vzorku šikmo do vody. Repliky živočišných vzorků je vcelku snadné vyčistit, dělá se tak za pomoci 20% - 40% kyseliny chromové. Rostlinné buňky představují větší problém, zejména kvůli přítomnosti buněčné stěny potažmo celulózy. Kvůli tomu musí být takovéto repliky plaveny aspoň na 70% kyselině sírové. Této koncentrace je dosaženo postupně v průběhu několika hodin, podobně se pak vrací i replika zpět do vody. Tyto repliky jsou pak ponořeny do vody, než jsou vloženy do 20% kyseliny chromové. Po odstranění zbytku biologického materiálu jsou repliky propláchnuty v destilované vodě a umístěny na síťky. Síťky se vyrábějí z odolných kovů jako je nikl, měď nebo zlato. Rozlišujeme je podle počtu okének. Jako nosné síťky pro repliky se používají síťky s děrováním 100, 150, 200, 300, 400, síťky s nižším počtem děrování (50, 75) musí být před umístěním repliky pokryty formovarovou blánou. V některých výjimečných případech přípravy preparátů
se
může
použít
síťka
potažená
vrstvou
lecitinu,
ale
soudržnost této síťky a samotné repliky je velmi malá. 2.3.8.
Artefakty
Existuje mnoho artefaktů, které se mohou vyskytnout v průběhu přípravy preparátů metodou freeze-etching, přičemž každá je spojena s různými kroky této techniky a dají se shrnout následovně: artefakty indukované kryoprotektantem, ledové artefakty, artefakty vzniklé při lámání a leptání, artefakty vzniklé při napařování a stínování, artefakty způsobené čištěním repliky.
49
3.
Cíl práce
Cílem této práce bylo získat snímky biologických preparátů za pomoci různých detektorů a za nastavení různých parametrů mikroskopu. Úkolem této práce bylo: 1. Porovnání metody STEM-BF (bright field) a STEM-DF (dark field) 2. Zjistit, jak ovlivňuje urychlovací napětí kvalitu snímku 3. Nasnímat chybné snímky (rozostření, nabíjení, vitrifikace…) 4. Naměřit limitní snímky STEM a porovnat je se snímky z TEM 5. Proměřit závislost velikosti stopy paprsku na jeho intenzitě 6. Porovnání mikrografů biologických preparátů pořízených za pomoci dostupných detektorů 7. Naučit se obsluhovat SEM, TEM a STEM 8. Vyhodnotit pořízené snímky
50
4.
Metodika
4.1. Mikroskop MIRA3 FEG-SEM
a
b
c
d
Obrázek 12: MIRA3 FEG SEM: a) tubus mikroskopu, b) komora, c) stolek pro preparáty, d) jednotlivé detektory (www.tescan.cz) Mikroskop MIRA3 FEG SEM je rastrovacím elektronovým mikroskopem, jehož výrobcem je brněnská firma TESCAN a.s. Tento mikroskop se vyznačuje vysokou rozlišovací schopností díky Schottkyho katodě. Poslední modely tohoto mikroskopu se vyznačují nejlepší elektronikou, která poskytuje rychlejší snímání a zpracování obrazu. Unikátní tříčočkový systém Wide field optics umožňuje pozorování v různých skenovacích
módech.
Mikroskop
MIRA3
FEG
SEM
(někdy
také
označován jako MIRA3 LMU) umožňuje pozorovat preparáty v různých hodnotách vakua, od vakua vysokého (až 10-4 Pa) až po vakuum nízké (do 500 Pa). Vakua se v tomto mikroskopu dosahuje za pomoci suché a turbomolekulární vývěvy v komoře, v tubusu se pak vakua docílí za pomoci vývěvy iontové. Komora tohoto mikroskopu může mít trojí velikost a lze v ní pozorovat i preparáty velikosti cigaretové krabičky. Stolek mikroskopu umožňuje pohyb ve třech osách (x, y, z), dále je možné naklonění a otáčení vzorku. 51
Detektory v tomto elektronovém mikroskopu jsou tvořeny na bázi YAG krystalů, jsou to tedy scintilační detektory, jejichž funkce je založena na vybuzení elektronu do vyššího energetického stavu, přičemž jejich návrat do původního stavu je doprovázen zábleskem. Výjimku tvoří přídavný TE detektor (STEM), jenž je tvořen dvěma polovodičovými detektory. 4.1.1. Jedním
Elektronově optická soustava a vakuový systém ze
základních
parametrů
elektronových
mikroskopů
je
urychlovací napětí. Urychlovací napětí mikroskopu Mira se může pohybovat mezi 200 V – 30 kV. Pro metodu STEM je rozhodně vhodnější hodnota 30kV. Rozlišení tohoto mikroskopu je pak pro SE detektor při hodnotě urychlovacího napětí 30 kV rovno 1,2 nm. Velikost proudu ve svazku je 2 pA až 100 nA. Rychlost skenování souvisí s délkou akvizice obrazu. Čím je tato rychlost vyšší, tím méně šumu obsahuje snímek, avšak tím delší je expozice preparátu elektronovému svazku. Tato rychlost je nastavitelná v krocích nebo plynule a pohybuje se od 20 ns – 10 ms na pixel. Hodnoty vakua byly popsány v minulé kapitole, je jen nutné podotknout, že vakuum v blízkosti trysky je mnohem vyšší než v komoře. Pohybuje se pod10-7 Pa. 4.1.2.
Zobrazovací režimy
Tato podkapitola pojednává o skenovacích režimech elektronového mikroskopu. Každý z těchto režimů je něčím specifický a tudíž se hodí každý na trochu jinou práci. Mikroskop MIRA poskytuje čtyři základní zobrazovací režimy pro zlepšení kvality obrazu. Prvním a asi i nejpoužívanějším z nich je režim resolution, který se používá pro vysoké rozlišení obrazu. Depth, režim s velikou hloubkou ostrosti. Dalším typem je režim field, který se vyznačuje širším pracovním polem. Posledním typem je režim wide field.
52
Tento režim má velmi malé zvětšení a slouží pro dobrou orientaci na vzorku, čímž částečně simuluje světelný mikroskop. 4.1.3.
Detektory
Mikroskop MIRA3 FEG SEM může mít mnoho detektorů, které se dají jednoduše
připojit.
Jsou
to
například
detektory
SE
(secondary
electrons), InBeam SE, LVSTD (low vacuum secondary), BSE (back scattered electrons), STEM detektor (transmitted electrons). Nejčastěji používaným detektorem je bez pochyby klasický SE detektor. Jedná se o zařízení, které zachycuje a následně vyhodnocuje signál
sekundárních
elektronů.
Tento
detektor
má
neomezenou
životnost a je umístěn kolmo na komoru, jak lze vidět na obrázku 12. Detektor, který je co do detekce signálu v podstatě stejný jako SE, je detektor InBeam SE. Opět se detekují sekundární elektrony, ale umístění je jiné. Tento typ detektoru je umístěn v tubusu mikroskopu, přesněji pak v objektivu. Užívá se pro vysoké rozlišení díky vlastnosti pracovat na minimálních vzdálenostech. Třetím typem je detektor zpětně odražených elektronů BSE detektor, který poskytuje informaci o materiálovém kontrastu vzorku. BSE detektorů je více druhů, např. výsuvné, dvou – scintilátorové nebo čtyřkvadrantové. LVSTD je detektor, který se užívá také pro detekci sekundárních elektronů (jako SE a InBeam SE), ale tentokrát jsou tyto elektrony detekovány za nízkého vakua. Posledním typem detektoru, se kterým je možno se u tohoto mikroskopu setkat, je TE detektor neboli STEM. Za pomoci tohoto detektoru lze mikroskop MIRA3 FEG SEM použít částečně jako prozařovací elektronový mikroskop. Detektor se vkládá přímo do komory a za pomoci důmyslného systému se připevňuje přímo ke stolku pro preparáty. Velikým omezením tohoto detektoru oproti mikroskopu TEM je urychlovací napětí.
53
Tabulka 4: Pracovní vzdálenosti jednotlivých detektorů detektor pracovní vzdálenost (mm) BSE 8 SE 5 InBeam SE 3 a méně STEM 3 a méně LVSTD
Elektronový
5
mikroskop
má
standartně
ještě
širokou
škálu
různých přídavných zařízení. Jedním z takových důležitějších je IR-TV kamera pro pohled do komory. Je to poměrně nezbytně zařízení, pomocí něhož se dá kontrolovat dění v komoře. Lze tak kontrolovat polohu vzorku oproti tubusu, přičemž by k jejich dotyku nemělo v žádném případě dojít, jinak hrozí vážné poškození mikroskopu. 4.1.4.
Práce s mikroskopem Mira FEG SEM
a d c b
g
e f
Obrázek 14: Pracovní menu mikroskopu Mira: a) pohotovostní ikony, b) snímek, c) záběr z IR-TV kamery, d) histogram jasu a kontrastu, e) poloha stolku, f) hodnota vakua, g) parametry snímání
54
Veškerá komunikace s mikroskopem se odehrává za pomoci řídícího počítače prostřednictvím klávesnice, myši a trackballu. Trackball je zařízení, za pomoci kterého se ostří, zvětšuje a zmenšuje, korigují se jím stigmátory, centruje se jím paprsek a dá se s ním i upravovat jas a kontrast obrázku atd. Software MiraTC užívá operačního systému Windows a je velice příjemný pro uživatele. Veškeré důležité operace jsou odděleny od těch, které řadový uživatel nepotřebuje měnit. Pracovní menu je pak vidět na následujícím obrázku. Po uzavření komory a stlačení tlačítka PUMP v menu se v komoře vyčerpá vzduch. Svazek začne skenovat po preparátu až po stlačení tlačítka BEAM ON, kdy se otevře clona v tubusu mikroskopu. V místě označeném jako parametry snímání si volíme rychlost skenování, hodnotu urychlovacího napětí, typ detektoru apod. Dále jsou zde také funkce, které upravují a centrují svazek, nalézá se zde i korekce astigmatismu (stigmátory). Vlevo se nachází místo popsané jako pohotovostní ikony, tj. ikony, které urychlují práci při snímání, jedná se o ikony WD (pracovní vzdálenost = working distance), zvětšení, autosignál (upravuje poměr jasu a kontrastu podle Gaussova rozdělení) i zde se nacházejí stigmátory. V samotném snímku lze otevřít tzv. fokusační okno (dělá se dvojitým poklepáním do okna), je to menší okno než celý snímek a lépe se v něm zaostřuje a stigmuje. S tímto oknem se dá libovolně pohybovat po snímku, je to výhodné například při ostření, protože ostřit na šedý povrch moc nelze. Proto je dobré si fokusační okno posunout na nějakou nečistotu. V místě, které je popsáno jako poloha stolku, se nachází 7 číslic (1-7),
které
popisují
místa
k uchycení
preparátů,
děje
se
tak
prostřednictvím stubu. Kliknutím na libovolný preparát se vzorek
55
posune pod objektiv a může být snímán. V případě snímání STEM lze uchytit pouze jeden preparát a to doprostřed stolku. Je-li po všech úpravách snímek dobře doostřen a obsluha mikroskopu je se snímkem spokojena, je možné uložit jej v podobě mikrogramu (fotografie) v různých formátech (jpeg, tiff, png …). Jednou z informací, která se společně se snímkem automaticky ukládá, jsou poznámky o nastavení všech parametrů mikroskopu, za kterých byl snímek pořízen.
4.2. Příprava některých preparátů Příprava preparátů probíhala různými cestami od freeze-etching replik až po chemickou cestu přípravy a pokovení některých preparátů. Jedním z preparátů, který byl připraven standartní technikou pro rastrovací elektronové mikroskopy, byl vzorek zubní výplně. Následující odstavce shrnují jeho chemickou cestu přípravy. Příprava preparátu byla rozložena do dvou dnů. První den proběhla desinfekce povrchu zubu. Poté byl vzorek přenesen na kultivační destičku a nechal se inkubovat 24 hodin při 37 °C s 5% CO2. Druhý den byl potom vzorek zafixován za pomoci 3% glutaraldehydu ve fosfátovém pufru s pH 7,2. Po vypaření fosforečného pufru přišlo na řadu odvodnění vzorku, které se dělo vzestupnou alkoholovou řadou 0,50, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 0,95 a 0,99 vždy po deseti minutách. Alkoholem použitým při tomto odvodňování byl ethanol. Výsledný preparát nebyl při svém snímání pokoven.
56
5.
Výsledky
V elektronové mikroskopii je poměrně velikým problémem získat kvalitní a vypovídající snímek, neboť při sebemenší změně jednoho z fyzikálních parametrů je třeba doladit ostatní tak, aby byl snímek dobře čitelný, při změně preparátu (například preparátu pokoveného za nepokovený, nebo FE repliky za nanořez) opět nemůžeme aplikovat parametry užité z předchozí práce. Pro přehlednost této práce jsou výsledky členěny do několika kapitol, které popisují různá nastavení mikroskopu, druhu užitého detektoru, měnící se hodnoty urychlovacího napětí, závislost intenzity paprsku na velikosti stopy, srovnání snímku ze STEM detektoru a TEM. V každé z kapitol bude pro přehlednost nadepsán krátký úvod k tomu, jakou problematiku jednotlivá kapitola řeší. Dále tam pak budou přímo pořízené snímky s jednotlivými popisky. V třetí části kapitoly bude pak tabulka, která bude ukazovat, za jakých parametrů byl daný snímek či dvojice snímků pořízen (pracovní vzdálenost, zvětšení, urychlovací napětí, skenovací režim a velikost skenovací stopy).
57
5.1. Biologický popis preparátu Na většině snímků byly snímány repliky buněk lidské leukémie HL-60, pořízené metodou freeze–etching. Na ostatních snímcích je pak možno vidět
preparáty
připravené
standartní
technikou
pro
rastrovací
elektronové mikroskopy, vzorek krve, pořízené za pomoci SE detektoru, či BSE detektoru, plíseň sýra byla pak pořízena LVSTD detektorem, vzorek zubní výplně pořízené za pomoci InBeam SE detektoru.
Obrázek 1: Popis buněčných organel pozorovaných na snímku repliky buňky HL-60: m) mitochondrie, mi) micely, er) endoplazmatické retikulum,
j)
buněčné
jádro,
jm)
jaderná
membrána,
cm)
cytoplazmatická membrána, jp) proteiny v nukleoplasmě , vpravo dole jednotlivá měřítka snímků pořízených skenovacím el. mikroskopem za pomoci TE detektoru. Snímek je z důvodu větší přehlednosti roztažen. 58
čk kd 5 µm Snímek 2: Biologický popis – vzorek krve: čk) červené krvinky (erytrocyty), kd) krevní destičky (trombocyty), vpravo dole měřítko snímku pořízeného skenovacím elektronovým mikroskopem za pomoci SE detektoru, preparát byl pokryt 10 nm uhlíku
p
50 µm
Snímek 3: Plíseň sýra niva: p) hyfy plísně, vpravo dole měřítko snímku pořízeného skenovacím mikroskopem a pomoci LVSTD detektoru
59
s
sl
2µm Snímek 4: Biologický popis - zubní výplň: s) streptokoky, sl) podložní substrát – lidská slina a v ní přítomné látky, v pravo dole měřítko snímku pořízeného skenovacím mikroskopem za pomoci InBeam SE detektoru. Preparát nebyl pokoven
60
5.2. Porovnání metody STEM-BF a STEM-DF Metody STEM – BF (bright field – světlé pole) a STEM – DF (dark field – tmavé pole) byly popsány v kapitole 2.1.2.3. a)
b)
sm
tm
500 nm Obrázek 5: Srovnání metody STEM – BF a STEM – DF: a) metoda světlého pole, b) metoda tmavého pole, tm) tmavá místa v důsledku dopadu centrálního svazku, sm) světlá místa v důsledku vyclonění centrálního pole svazku Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 5 Oba dva snímky byly pořízeny za stejných podmínek (lze si všimnout různé hodnoty třeba u pracovní vzdálenosti, to je zapříčiněno tím, že se změní BF na DF je třeba preparát ještě trochu doostřit a důsledku ostření se trochu mění i pracovní vzdálenost). Tabulka 1: Fyzikální parametry snímků na obrázku 5 Pracovní vzdálenost 1,66 – 1.67 mm
Zvětšení 185170
Urychlovací napětí 30 kV
61
Skenovací režim resolution
Velikost stopy 1,94 nm
a)
b)
sm
tm
500 nm Obrázek 6: Srovnání metody STEM – BF a STEM – DF: a) metoda tmavého pole, b) metoda světlého pole, tm) tmavá místa v důsledku dopadu centrálního svazku, sm) tmavá místa v důsledku vyclonění centrálního pole svazku Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 6 Oba dva snímky byly opět pořízeny za stejných podmínek, avšak tentokrát jsou snímky pořízeny za mnohem většího zvětšení. Preparát se opět minimálně doostřoval, ale tak málo, že to na hodnotu pracovní vzdálenosti nemělo vliv. Tabulka 2: Fyzikální parametry snímků na obrázku 6 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
1,62 mm
300000
30 kV
resolution
1,93 nm
5.3. Vliv urychlovacího napětí na kvalitu snímku Napětí mezi katodou a anodou je jedním z nejdůležitějších parametrů elektronových mikroskopů. Je to také největší rozdíl mezi SEM a TEM mikroskopem. V první následující subkapitole bylo postupně snižováno urychlovací napětí, přičemž ostatní parametry byly korigovány, aby byl 62
nasnímán
kvalitní
snímek.
V druhé
následující
subkapitole
byl
zafixován poměr jasu a kontrastu na jedné hodnotě a opět se snižovalo urychlovací napětí. 5.3.1. Klesající urychlovací napětí vs. kvalita snímku Snímky byly nasnímány s klesajícím napětím a to s hodnotami 30 kV, 26 kV, 24 kV, 22 kV, 20 kV, 18 kV, 16 kV. Při doostření prvního snímku (30 kV) byla nafocena kvalitní mikrofotografie, která je vidět na snímku 5.
1 µm Snímek 7: Urychlovací napětí 30 kV: optimální nastavení snímku, pro pozorování organel. Na snímku si lze všimnout dokonalé ostrosti ve všech jeho místech.
63
ko
ko
ko
Obrázek 8: Porovnání snímků stejné struktury repliky při různých urychlovacích napětích: a) U = 26 kV, b) U = 24 kV, c) U = 22 kV, d) U = 20 kV, e) U = 18 kV, f) U = 16 kV, vzp) postupně vypalovaní čar do zorného pole v důsledku dlouhodobého vystavení repliky elektronovému svazku, ko) klesající ostrost organel v důsledku nízkého urychlovacího napětí Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 8 Série snímku byla záměrně pořízena za ne úplně maximálního zvětšení, je to jednak dáno tím, že by ovlivnění urychlovacím napětím bylo větší a jednak také kvůli tomu, že když se snímek doostřuje, stigmuje a centruje se dělo elektronů, tak se mnohem rychleji interakcí uhlíku s elektrony vypalují zorné pole. Při snižování urychlovacího napětí byla znatelná změna poměru jasu a kontrast, který musel být před každým
64
snímáním změněn. Částečný posun organel je způsoben nedokonalým připevněním preparátu na nosnou síťku. Tabulka 3: Fyzikální parametry snímků na obrázku 8 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Zobrazovací režim
Velikost stopy
3,77–3,79 mm
92700
30 – 16 kV
resolution
2,23-3,32 nm
. 5.3.2. Změna urychlovacího napětí za stálého poměru jasu a kontrastu Při pozorování snímků za zmenšování urychlovacího napětí byla viditelná změna jasu a kontrastu snímků. Proto byl v této kapitole tento poměr zafixován na jedné hodnotě a opět se měnilo urychlovací napětí. Tato závislost byla navíc proměřována za většího zvětšení. Poměr jasu a kontrastu byl zafixován na hodnotách jas = 87,5% a kontrast = 23,7%. a)
černá
bílá
b)
černá
65
bílá
c)
černá
bílá
d)
černá bílá
Obrázek 9: Klesající urychlovací napětí, za stálého poměru jasu a kontrastu: a) U = 30 kV, odpovídající histogram b) U = 27 kV, odpovídající histogram, c) U = 25 kV, odpovídající histogram, d) U = 23 kV, odpovídající histogram, stoupající tmavost snímku je způsobena právě klesající hodnotou urychlovacího napětí Tabulka 4: Zobrazení jasu a kontrastu v závislosti na urychlovacím napětí: Stupně šedi Urychlovací napětí (kV)
192 30
112 27
120 25
58 23
Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 9 Snímky byly nasnímány za stejných hodnot zvětšení a pracovní vzdálenosti, která se drobně mění kvůli mírnému doostřování. Tabulka 5: Fyzikální parametry snímků na obrázku 9 Pracovní vzdálenost 4,85 mm – 4,84 mm
Zvětšení 220000
30 kV
66
Urychlovací napětí 27kV 25 kV 23 kV
5.4. Artefakty vzniklé nevhodným nastavením přístroje a chybnou přípravou biologického preparátu Tato kapitola je členěna do několika podkapitol. Jsou zde snímky biologických preparátů, které byly nevhodně zafixovány, pokoveny nebo vyčištěny nebo byly nevhodně nastaveny parametry skenování těchto preparátů. Dále jsou zde přímo ukázány některé artefakty vzniklé při vytvoření repliky biologických membrán metodou freeze – etching. 5.4.1. Nabíjení preparátu Tentokráte se nejedná o preparát připravený metodou freeze-etching, ale o preparát připravený chemickou cestou přípravy. Nebylo snímáno STEM detektorem, nýbrž SE detektorem.
Obrázkek 10: Nabíjení preparátu: a) snímek preparátu ovlivněného nabíjením, b) snímek preparátu neovlivněného nabíjením, p) nabíjení preparátu se projeví pulzováním elektronového svazku. Na snímku se nabíjení
preparátu
projeví
vznikem
kontrastních
čar
ve
směru
skenování nebo vznikem bodů s vysokým jasem Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 10 Preparát byl pozorován bez pokovení. Snímky byly snímány za stejných hodnot fyzikálních parametrů, které jsou shrnuty v tabulce 6.
67
Tabulka 6: Fyzikální parametry snímků na obrázku 10 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
5,28 mm
12400
5 kV
resolution
5,16 nm
5.4.2. Rozostřené snímky Při práci s elektronovým mikroskopem je velice těžké nafotit dokonale ostrý snímek. Je nutné zdůraznit, že čím větší zvětšení snímku, tím je práce s ním těžší a je někdy těžké zaostřit to, co chceme vidět (ať už z důvodu vypalování pole, pulsování obrazu, různé hloubky ostrosti preparátu apod.).
Obrázek 11: Srovnání snímků s různou ostrostí: a) dokonale ostrý snímek s 2D FFT (2D fast fourier transform) b) nadostřený snímek s 2D FFT c) podostřený snímek s 2D FFT
68
V této kapitole byly pořízeny 3 snímky za menšího zvětšení. Přičemž jeden ze snímků je nadostřen (ideální ostrost tohoto snímku je pod touto hranicí) další snímek je dokonale ostrý a poslední je pak podostřen (ideální ostrost snímku je nad touto hranicí). Tyto tři mikrogramy jsou zobrazeny na obrázku 11. Dále je na tomto obrázku vidět každému snímku příslušná 2D Fourierova transformace. Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 11 Hodnoty zvětšení se u jednotlivých snímků mírně liší v závislosti na rozostření, v tabulce je uvedena hodnota dokonale ostrého snímku. Snímek nadostřený má hodnotu vyšší, snímek podostřený pak hodnotu nižší. Tabulka 7: Fyzikální parametry snímků na obrázku 11 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
1,67-1,69 mm
59140
30 kV
resolution
1,94 nm
5.4.2.1. Topografie povrchu preparátu ovlivňující ostrost snímku Při snímání preparátů metodou STEM detektorem hraje velkou roli výška preparátu (topografie povrchu). Pak se při ostření snímku musíme soustředit na místo, které chceme ostřit, protože místo, které je výš nebo níž, je pak rozmazané. Na snímku 12 můžeme vidět místa zaostřená i rozostřená ve srovnání se snímkem ostrým, který byl pořízen na rovnějším místě preparátu.
69
Obrázek 12: Topografie povrchu preparátu ovlivňující lokálně ostrost snímku: a) značná topografie povrchu, b) malá topografie povrchu, om) ostrá místa, rm) rozostřená místa Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 12 Oba
dva
snímky
byly
pořízeny
za
různých
hodnot
fyzikálních
parametrů, které jsou shrnuty v tabulce 8. Tabulka 8: Fyzikální parametry snímků na obrázku 12 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
a)
1,62 mm
288000
30 kV
Resolution
1,93
b)
1,17
93000
30 kV
Resolution
2,08
5.4.3. Některé artefakty vzniklé při přípravě replik metodou freezeetching Jak již bylo popsáno v teoretické části, popis artefaktů vzniklých při tvorbě replik by dalece přesahoval rámec této práce. V této podkapitole budou proto ukázány jen některé artefakty, jako je vitrifikace a špatně vymytá replika, které se nejčastěji objevují na replikách snímaných v této práci. 70
5.4.3.1. Vitrifikace Vitrifikace je jeden z poměrně častých artefaktů při přípravě preparátů obsahujících velké množství vody. Voda v buňce je zmražena příliš pomalu a vytvoří se množství velkých krystalů vody. Snímky jsou pak značně znehodnoceny, krystalky ledu totiž zničí morfologii cytoplazmy a nukleoplasmy,
v některých
případech
může
dojít
až
k protržení
membrán, krystaly ledu zůstanou na povrchu repliky a je možné si je pak splést s proteiny nebo póry v membráně.
Obrázek 13: Vitrifikace vzniklá pomalým zamrazením preparátu: a) replika s vitrifikací, b) replika bez vitrifikace, kl) krystalky ledu v nukleoplasmě Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 13 Oba dva snímky byly pořízeny za podobných fyzikálních parametrů, které jsou shrnuty v tabulce 9. Tabulka 9: Fyzikální parametry snímků na obrázku 13
a) b)
Pracovní vzdálenost 2,3 mm 1,62 mm
Zvětšení 143500 153260
Urychlovací napětí 30 kV 30 kV
71
Skenovací režim resolution resolution
Velikost stopy 2,2 nm 1,93 nm
5.4.3.2. Špatně vymytá replika Čištění repliky je jeden z posledních kroků při tvorbě platinovouhlíkových odlitků. Celý postup čištění repliky je popsán v teoretické části v kapitole 2.3.7.
Obrázek 14: Špatně vymytá replika a nečistota v replice: a) replika bez rušivých nečistot, b) replika s dvěma druhy nečistot,
N1) nečistota
vzniklá špatným vymytím repliky, N2) nečistota nacházející se v replice Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 14 Snímky byly pořízeny za podobných hodnot, které jsou shrnuty v tabulce 10. Tabulka 10: Fyzikální parametry snímků na obrázku 14 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
a)
1,62
287700
30 kV
resolution
1,93 nm
b)
4,84
238500
30 kV
resolution
2,1 nm
Urychlovací Skenovací napětí režim
.
72
Velikost stopy
5.4.4. Vypalování zorného pole Tento artefakt, který ovšem nemá co dočinění s metodou freeze-etching, se objevuje jak u nanořezů tak u replik. Značně tak komplikuje práci ve skenovacím elektronovém mikroskopu. b)
a)
vp
Obrázek 15: Vypálené zorné pole v důsledku velkého zvětšení: a) snímek s několikanásobně vypáleným zorným polem, b) totéž místo bez vypáleného zorného pole, vp) několikanásobně vypálené místo Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 15 Oba dva snímky byly pořízeny za podobných fyzikálních parametrů, které jsou shrnuty v tabulce 11. Tabulka 11: Fyzikální parametry snímků na obrázku 15 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací Skenovací napětí režim
Velikost stopy
a)
1,69 nm
183330
30 kV
resolution
1,94 nm
b)
1,69 nm
59140
30 kV
resolution
1,94 nm
5.5. Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku V této kapitole bude série snímků, které budou mít různou hodnotu intenzity paprsku (beam intensity = BI) a v závislosti na této hodnotě se bude měnit velikost stopy (spot size = SZ). Při práci s mikroskopem lze 73
manuálně nastavit velikost stopy i intenzitu paprsku. Mikroskop MIRA při nastavení velikosti stopy 0 nm sám ihned propočítá ideální intenzitu paprsku a tím pádem i nejmenší možnou velikost stopy. Při nastavení velikosti stopy 0 nm software mikroskopu Mira vypočítal při dané pracovní vzdálenosti hodnotu BI = 9,77 a SZ = 2,38 nm. Měření probíhalo za 12 – ti různých hodnot BI. Z těchto měření bylo pořízeno 7 snímků. První z nich je pořízen za hodnoty BI = 15 poslední pak za BI = 4.
74
g)
a
BI = 15
SZ = 7,1 nm
b
BI = 13
SZ = 3,67 nm
c
BI = 11
SZ = 2,52 nm
d
BI = 8
SZ = 2,46 nm
e
BI = 6
SZ = 2,71 nm
f
BI = 4
SZ = 3 nm
g
BI = 9,77 SZ = 2,38 nm
Obrázek 16: Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku: a) – f) snímky s klesající hodnotou BI, g) snímek pořízený za softwarem ideální spočtené hodnoty BI a nejmenší možné stopy Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 16 V následující tabulce jsou hodnoty nastavených parametrů, při kterých byly snímky nasnímány. Tabulka 12: Fyzikální parametry snímků na obrázku 16 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
4,84 mm
346140
30 kV
resolution
viz. snímek
V následující tabulce jsou všechny naměřené hodnoty velikosti stopy (SZ) a intenzity paprsku (BI). 75
Tabulka 13: Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku Měření
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
SZ (nm)
7,1
3,67
2,52
2,4
2,39
2,39
2.4
2,41
2,42
2,46
2,71
3
BI
15
13
11
10
9,8
9,6
9,4
9,2
9
8
6
4
Hodnoty jsou vyneseny v následujícím grafu, ze kterého byla určena minimální velikost stopy. Hodnota BI odpovídá velikosti (hustotě) proudu
elektronového
svazku.
V mikroskopu
Mira
je
to
ovšem
bezrozměrná orientační veličina.
velikost stopy (nm )
Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
intenzita paprsku
SZ = 2,4 nm ± 0,1 nm
BI = 9,7 ± 0,6
Programem Origin byla určena minimální velikost stopy na 2,4 nm při intenzitě paprsku 9,7.
5.6. Porovnání snímků z TEM a STEM detektoru V této kapitole budou zobrazeny snímky ze skenovacího mikroskopu, pořízené a pomoci STEM detektoru a snímky pořízené na prozařovacím 76
mikroskopu (TEM). V případě STEM detektoru se jedná o snímek s největším možným zvětšením, které bylo za pomoci mikroskopu Mira a pořízených replik nasnímat. Zároveň se jedná o zvětšení, při kterém lze snímek dobře vyladit, a nedochází zde ke vzniku výrazných artefaktů. a)
b)
pr
Obrázek 17: Porovnání snímků STEM a TEM: a) Snímek pořízený za pomoci STEM, b) snímek pořízený za pomoci TEM, pr) komplexy proteinů (velikost zhruba 20 nm). Na obou snímcích je vidět jaderná membrána s jadernými póry a dobře viditelnými proteiny. Na snímku ze STEM detektoru jsou proteiny lépe viditelné oproti snímku TEM.
77
Fyzikální podmínky získání snímků na obrázku 17 Hodnoty fyzikálních parametrů, ze kterých byly snímky pořízeny jsou shrnuty v následující tabulce. Tabulka 14: Fyzikální parametry snímků na obrázku 17 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
1,17 nm
118560
30 kV
resolution
2,07 nm
transmisní
prozáření celým zorným polem
a)
140000
b)
5.7.
Snímky
různých
70 kV
preparátů
pořízené
různými
detektory Skenovací mikroskop Mira je vybaven různými detektory popsanými v teoretické části práce. V této kapitole budou ukázány snímky z těchto detektorů, které budou doplněny snímky pořízenými metodou STEM detektorem
a
snímky
pořízenými
mikroskopem.
a)
b)
78
transmisním
elektronovým
c)
d)
e)
f)
Obrázek 18: Porovnání snímků z různých detektorů: a) snímek pořízený
SE
detektorem,
vzorek
krve
b)
snímek
pořízený
BSE
detektorem, fibroblast c) snímek pořízený InBeam SE detektorem, replika HL-60 d) snímek pořízený LVSTD detektorem, plíseň sýra niva e) snímek pořízený TE detektorem, replika HL-60 f) snímek pořízený transmisním mikroskopem Morgagni 268 D, replika HL-60 Fyzikální popis snímků na obrázku 18 Různé hodnoty fyzikálních parametrů, za kterých byly jednotlivé snímky pořízeny, jsou uvedeny v následující tabulce. 79
Tabulka 15: Fyzikální parametry snímků na obrázku 18 Pracovní vzdálenost
Zvětšení
Urychlovací napětí
Skenovací režim
Velikost stopy
a)
5,27 mm
12400
5 kV
resolution
4,45 nm
b)
10,97 mm
5030
10 kV
resolution
4,91 nm
c)
1,66 mm
185160
30 kV
resolution
1,94 nm
d)
8,11 mm
10160
10 kV
depth
-
e)
1,67 mm
59850
30 kV
resolution
1,94 nm
transmisní
prozáření celým zorným polem
f)
14000
70 kV
80
6. Diskuze 6.1. Porovnání snímků metody STEM – BF a STEM - DF Při
práci
s elektronovým
mikroskopem
MIRA3
za
použití
STEM
detektoru jsou softwarem mikroskopu nabízeny dva druhy snímání dark field a bright field. Díky vyclonění centrálního svazku u metody dark field mají pak paprsky po průchodu kondenzorem větší úhel dopadu a v důsledku toho vznikají na snímcích pořízených touto technikou světlejší místa, jak lze vidět na snímku 5b. U metody bright field se naopak nechává dopadat střed svazku (krajní část paprsku je vycloněna) na preparát, paprsky mají menší úhel dopadu. Díky tomu se v metodě bright field objeví na velkých lomech tmavá místa, jak lze vidět na snímku 5a. O konvexnosti nebo konkávnosti těchto míst by šlo rozhodnout pouze ze směru naprášení povrchové vrstvy platiny. Někdy je směr naprášení lépe čitelný u metody dark field. Když se mluví o snímání STEM detektorem, myslí se tím ve většině případů bright field, které je přirozenější a snímky jsou podobnější TEM. Při snímání bylo zjištěno, že metoda dark field je nejen dobrým doplňkem k bright field, ale v některých případech lépe vykreslí určitá místa na snímku. Obě dvě metody lze dobře použít i za poměrně velkého zvětšení, jak je vidět v tabulce 1 a 2. Při přepínání mezi metodami, je z důvodu změny dráhy elektronového paprsku třeba občas doostřit snímek, a tím pádem nepatrně změnit pracovní vzdálenost.
6.2. Porovnání snímků s různým urychlovacím napětím Urychlovací napětí na mikroskopu MIRA se pohybuje od jednotek kV až k 30 kV. Pro práci se STEM detektorem se uvádí jako ideální hodnota 30 kV. Při této hodnotě mají elektrony dostatečně velkou energii, aby prošly skrze preparát v místech, kde není navázána kontrastní látka nebo napařená platina. Snímek preparátu je pořízen detekcí prošlých elektronů nikoliv odražených, jak je tomu u skenovacích detektorů. 81
Při srovnání těchto snímků bylo snižováno urychlovací napětí a pořizovány snímky, které měly ukázat, za jaké nejnižší hodnoty urychlovacího napětí lze ještě pořídit kvalitní snímek. Práce na tomto úkolu byla hodně komplikována, protože při změně urychlovacího napětí bylo potřeba doostřit na preparát a v některých případech centrovat trysku a korigovat astigmatismus paprsku. Právě díky těmto úpravám se obzvlášť u vyšších hodnot urychlovacího napětí začalo postupně vypalovat zorné pole, což lze vidět na všech snímcích (více o tom v kapitole Artefakty). Vypálené zorné pole ve spojení s nedokonale přichyceným preparátem k podložní síťce způsobilo černé pruhy, které se nachází na pravé straně většiny snímků. Pruhy přibývají, protože se preparát působením svazku posunuje vlevo. Právě z tohoto důvodu lze říci, že ideální hodnota urychlovacího napětí pro snímání kvalitního snímku STEM detektorem je možná i o něco nižší než 30 kV. Jak je vidět na snímku 8c, který je dokonale vyladěn a hodnota urychlovacího napětí je 22 kV. Co do času pořízení tohoto snímku byla doba pořízení jen o málo delší (1 minuta) než u snímku s 30 kV, ale hlavně se za nižší hodnoty urychlovacího napětí méně poškozuje preparát, což je velmi důležité. Kvalitně vyladěné snímky jsou i snímky 8d,e, avšak doba pořízení, přesněji řečeno doba vyladění těchto snímků, už byla značně dlouhá (do 5 minut). Při pozorování, které se opakovalo na dvou mikroskopech a s různým
krokem
snižování
napětí,
se
došlo
pokaždé
k
podobné hodnotě 12 - 14 kV, při které se stal snímek už značně rozmazaným a dále nevyladitelným. Po konzultacích s techniky byla označena
hodnota
urychlovacího
napětí
10
kV
jako
minimální
urychlovací napětí pro pořízení kvalitního snímku. Doba pořízení snímku už byla značně veliká a pohybovala se v desítkách minut.
82
Jak již bylo řečeno, měření probíhalo na více mikroskopech i na více preparátech a pokaždé s obdobným výsledkem. Ale je třeba říci, že nastavení mikroskopu, topografie povrchu preparátu, popřípadě kvalita repliky posunuje mírně tuto hranici na jednu či na druhou stranu. Je-li povrch repliky dokonale rovný, je možno pořídit kvalitní snímek daného místa i s menším urychlovacím napětím. Tento snímek ovšem už zabere hodně času, který se pohybuje okolo 30 minut. Tuto dobu značně zkrátí pevné uchycení repliky k podložní síťce. Na obrázku 8 není zhoršování kvality snímků až tak dobře viditelné, pro dobrou orientaci by bylo potřeba zobrazit větší snímek. Při postupném snižování napětí bylo vidět, že se mění poměr jasu a kontrastu a snímky postupně tmavnou, pokud není změněn histogram stupňů šedi. Na
obrázku
9
jsou
ukázány
detaily
snímků
s klesajícím
urychlovacím napětím a jim odpovídající histogramy. Tentokráte byl poměr jasu a kontrastu pevně zafixován. Hodnota jasu a kontrastu byla na snímku 9a nastavena co nejvýše, aby bylo možno nasnímat co nejvíce snímků s klesajícím napětím, než bude tento poměr tak nízký, že na snímku nic neuvidíme. Důvodem postupného tmavnutí snímků jsou elektrony s nižší energií. Tuto energii jim udílí klesající urychlovací napětí. Pomalejší elektron neprozáří preparát tak jasně a výsledný snímek proto tmavne. To potvrzují i přiložené histogramy k jednotlivým snímkům, kde vpravo se nachází bíla barva a vlevo černá, jednotlivé hodnoty mezi nimi jsou pak stupně šedi. Dotýká-li se pík jedné ze stran histogramu, například černé, znamená to, že jsou díky černé barvě některá místa na snímku nečitelná. U snímku 9a se nejvyšší pík pohybuje nejblíže bílé barvě a u snímku 9d pak nejblíže černé barvě. Je to logické, snímek 9a má urychlovací napětí 30 kV a snímek 9d 23 kV. Snímek 9b má nejvyšší pík blíže černé barvě, než snímek 9c. Tato situace nemůže nastat. V tomto případě byla změna opět způsobena 83
interakcí elektronů s uhlíkem, tedy vypálením zorného pole. Jinak řečeno, snímek 9b byl pořízen až jako poslední, do onoho místa bylo již několikrát páleno elektrony, a proto je snímek tmavší než snímek následující, ne však tmavší než snímek 9d. Tato tvrzení jsou shrnuta i v tabulce 4. Postup určitého tmavnutí snímku by byl ještě zřetelnější při větším zvětšení či při menší pracovní vzdálenosti. Tento úkol potvrdil to, že pro pořízení kvalitního snímku není třeba až tak vysoké urychlovací napětí jako je 30 kV. Jen za použití nižšího urychlovacího napětí je třeba změnit hodnotu jasu a kontrastu, aby nebyl moc tmavý.
6.3. Porovnání chybných snímků a snímků s artefakty Nabíjení preparátu není vadou jen vzorků biologických, ale týká se třeba také pevných látek a jiných vzorků. Ale ať už se jedná o jakýkoliv vzorek, nabíjení je rušivým elementem, který hodně znehodnocuje snímek. Projevuje se jako určité pulzování nebo stupňování snímku, jak lze vidět na snímku 10a. Nabíjení se netýká replik ani ultratenkých řezů, nýbrž preparátů, které nedostatečně odvádějí povrchový náboj. U biologického preparátu se k jeho odstranění používá pokovování a to buď zlatem, nebo uhlíkem v tloušťce několik desítek nm. Nelze však předem říci, jaký druh preparátu pokovit jakou tloušťkou, aby se nabíjení předešlo. Tloušťku pokovení
lze
odhadem
stanovit
podle
síly
„chargingu“
v obraze.
V některých případech se musí vrstvička i několikrát zvyšovat, než se dosáhne kýženého efektu. V případě pevných látek, které byly zmíněny výše, se používají různé vodivé pásky. Ostrost snímku je jedna z věcí, která nejvíce rozhoduje o kvalitě snímku a vůbec o tom, jaké detaily v něm uvidíme. V podstatě by se při každém snímkování v elektronovém mikroskopu mělo postupovat tak, že se nejdříve při malém zvětšení najde zajímavé místo, které chceme snímat, doostří se a zvětší se. Tento postup s ostřením a zvětšováním se
84
opakuje, dokud se v zorném poli neobjeví pozorované struktury v dostatečném zvětšení. Při doostřování se postupně zmenšuje velikost kroku (hodnota od 6 po 1 nastavitelná v pracovním menu mikroskopu). Pak se nemůže stát, že u snímku s velkým zvětšením bude výsledný obraz hodně rozoostřen. Doostřování je práce poměrně zdlouhavá, ale v podstatě vylučuje, že by byl nafocen rozmazaný snímek. Druhou
možností
je
nastavit
si
požadované
zvětšení
na
pozorovaném místě a pokusit se od oka doostřit. V takovém případě by bylo ideální pokaždé nafotit sérii fotografií, jakou lze vidět na obrázku 11. Protože se může stát, že snímek, který se vám jevil jako ostrý, se ve srovnání s lepším snímkem ukáže jako rozostřený. Nejlepší je nastavit trackballem snímek, který se jeví jako ostrý, vyfotit, pak při velikosti kroku jedna mírně otočit na jednu stranu opět vyfotit, pak mírně otočit trackballem na druhou stranu a znovu vyfotit. V důsledku korekce rozoostření fotografií se mění i pracovní vzdálenost jednotlivých snímků 11a, b, c. U snímků 11a, b, c jsou přiloženy obrazy 2D FFT, ze kterých je dobře čitelné, který snímek je ostrý a který ne. Středy obrazů se neberou v potaz, pouze až vyšší nosné frekvence. U 2D FFT obrazu snímku 11a vidíme méně zamlžený obraz než u 2D FFT obrazu snímků 11b, c. Obrazy 11b, c jsou celé zamlžené a malá ostrost je z nich patrná (fialové body, rozptýlené po celé ploše obrazu). Kdežto 2D FFT obraz snímku 11a má body soustředěné do jednoho útvaru. Z 2D FFT obrazu snímku 11a lze ještě vyčíst, že snímek není vystigmován v ose y (útvar je značně roztažen v ose x). 2D FFT obrazy mají totiž převrácené hodnoty. Dalším velikým problémem při práci s replikami je různorodá plasticita preparátu. Tento problém si lze často splést s rozostřeným snímkem, jenže v tomto případě celý snímek nikdy nedoostříte. Toto je poměrně zajímavé téma, protože třeba právě v mikroskopu TEM se hloubka ostrosti pro maximální rozlišení pohybuje okolo 500 nm, což dokonale zajišťuje hloubku ostrosti, například pro celý nanořez. 85
Hloubka ostrosti se pro mikroskop TEM vypočítá podle následujícího vztahu 2 R.S/a0 kde součin R.S. vyjadřuje požadované rozlišení, a0 je potom apertura objektivu. Všechny body uvnitř tenké vrstvy (nanořez, replika) jsou zaostřené, ale ve výsledném dvourozměrném snímku se jejich obrazy překrývají, to je důvod, proč se například při snímání membrán jeví výsledné snímky jako rozostřené (Nebesářová J 2001). Na snímku 12a je právě možno vidět v horní části zaostřené jaderné póry, kdežto v dolní části jsou jaderné póry rozmazané a roztažené. To je právě způsobeno různou topografií povrchu preparátu v těchto místech. Na snímku 12b je pak vidět snímek, jehož povrchová topografie není tak členěná a jaderné póry jsou pak na snímku ve všech místech zaostřeny. Menší roli může hrát i jiné zvětšení a pracovní vzdálenost těchto snímků. Na následující trojici obrázků 13, 14, 15 jsou zobrazeny některé artefakty, které jsou přímo spojené s FE replikami a jsou více popsané v teoretické části. Prvním artefaktem, který je zobrazen na snímku 13a, je vitrifikace. Vitrifikace je snadno identifikovatelná, protože se většinou vyskytuje v celém vzorku, a to jak v jádře, tak v cytoplazmě. Snímek je celý posetý drobnými ledovými krystalky, které značně zhoršují orientaci na snímku. Pokud ale potřebujeme snímat nějaké větší organely (mitochondrie, jádro, micely) jako celek, pokud nechceme zobrazovat detaily, jako třeba jaderné póry apod., stačí nám pak menší zvětšení a větší velikost stopy. Za těchto podmínek by neměla být vitrifikace viditelná a my nebudeme muset použít či vyrobit nový preparát. Dalším artefaktem je pak špatně vymytá replika. Jak můžeme vidět na snímku 14b, je více druhů nečistot, se kterými se můžeme při práci s replikami setkat. Ať už se jedná o nečistotu v replice, či nečistotu, která vznikla až špatným vymytím repliky, jsou tyto artefakty
86
velmi rušivým elementem a snímek s nimi je pro publikaci naprosto nepoužitelný. Po práci s replikami, které obsahovaly nečistoty, lze říct, že při poměrně značném snížení jasu a kontrastu, nejsou tyto nečistoty až tak viditelné, avšak celková orientace po snímku je poměrně těžká. Je to jedna z možností, kterou je dobré zkusit, pokud se neztratí při snížení jasu a kontrastu pozorovaná místa. Jinak jsou nečistoty jedna z věcí, se kterými už v samotném mikroskopu nelze nic dělat a je třeba vytvořit novou repliku. Nejčastějším artefaktem replik, ale i ultratenkých řezů bylo neustálé vypalování zorného pole. Na vypalování zorného pole má vliv mnoho parametrů, jednak je to určitě urychlovací napětí, pak je to také zvětšení, které souvisí s pracovní vzdáleností. Jak již bylo napsáno v kapitole o urychlovacím napětí, větší urychlovací napětí se rovná rychleji
vypálenému
zornému
poli.
Dejme
tomu,
že
udržujeme
urychlovací napětí někde mezi maximální hodnotou 30 kV a dle mého názoru ideální hodnotou 24 kV. Jak je možno vidět na snímku 15a, při zvětšení se poměrně rychle utvořilo vypálené zorné pole a při dalším zvětšení, které není vyneseno v tabulce 11, se ještě rychleji objevilo další. Zvětšení snímku 15a je 183000 a snímku 15b, na kterém není vypáleno
zorné
pole,
je
59000.
Zorné
pole
by
se
po
chvilce
kontinuálního snímání vypálilo i na snímku 15b, jen právě menší hodnota zvětšení nám dala větší časový interval pro pořízení ideálního snímku. Jak bylo zmíněno výše, s vypáleným zorným polem se setkáváme jak u FE replik tak u nanořezů. Původ vypáleného zorného pole u nanořezů je v něčem jiném. Při pozorování nanořezů, se zorné pole vypaluje rychleji a je to díky tomu, že elektrony se v tenkém řezu hromadí v pozorované oblasti a tato část se nabíjí, což pak vytváří zdánlivě vypálená místa. Pokud nanořez necháme nějaký čas ležet a 87
nepozorujeme ho v elektronovém mikroskopu, tak se po čase tato místa zmizí a přebytečný náboj je odveden. To potvrzuje různost vzniku vypáleného zorného pole u FE replik a nanořezů. Původ tohoto artefaktu u FE replik je v interakci elektronů s uhlíkem. Když necháme repliku v klidu (měsíce), tak je vypálené zorné pole stále viditelné. Při práci s elektronovým mikroskopem je těžké se vypalování zorného pole vyhnout, ale setkali jsme se s nějakými možnostmi, jak mu předejít. Jednou takovou možností, která byla aplikována u nanořezů, bylo, že jsme zaostřili na místo, které jsme nechtěli snímat, ale toto místo bylo poblíž a ve stejné rovině jako místo našeho zájmu. Po doostření na tomto místě jsme jen přejeli na to, co jsme chtěli snímat a nechali jednou přejet paprskem (tzv. single scan = pořízení snímku 1x). Pokud tento snímek nebyl zaostřen ideálně, nastaly dvě možnosti. První z nich byla vrátit se na jiné místo a zkusit snímek doostřit, druhá možnost pak vypnout paprsek a doostřit naslepo. Druhá možnost byla určitě rychlejší, ale chtěla dost cviku a navíc ne vždy se povedla.
6.4. Závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku Velikost stopy je důležitá při pozorování malých struktur. Čím menší je totiž stopa svazku v SEM mikroskopu, tím lépe jsou vykresleny malé struktury. Zároveň zbytečně veliká intenzita paprsku více poškozuje preparát, a proto je s ním práce náročnější. Tyto hodnoty se liší i v závislosti na pracovní vzdálenosti (working distance) neboť čím menší bude pracovní vzdálenost, tím menší může být i velikost stopy. Při snímání lze na mikroskopu nastavit i menší hodnotu spot size a to okolo 1,9 nm, ale to bylo při menší pracovní vzdálenosti. Takto malou pracovní vzdálenost už se ovšem nepovedlo znovu nastavit. Na snímcích 16a – 16f jsou snímky s klesající hodnotou beam intenzity (BI)a v této závislosti měnící se velikostí stopy. Na snímku 16g je pak zobrazeno stejné místo jako na všech snímcích, ale tentokráte je
88
snímané při spočítané hodnotě BI. BI odpovídá takové hodnotě, aby velikost stopy dosáhla nejmenší možné velikosti. Tuto hodnotu BI dokáže vypočítat sám software mikroskopu. Hodnoty BI se pohybovaly od 15 po 4 BI. BI je bezjednotková veličina, jedná se pouze o vnitřní úroveň intenzity elektronového svazku, nicméně výsledný proud dopadající na preparát je závislý na celkovém
nastavení
mikroskopu,
urychlovacím
napětí,
ohniskové
vzdálenosti apod. V praxi je většinou nutné tuto hodnotu změřit integrovaným pikoampérmetrem. Výsledné proudy se pak pohybují v řádech jednotek pikoampérů do jednotek nanoampérů. Při měření bylo započteno 12 hodnot, ale ne při každé hodnotě byl získán snímek. Při vyšší hodnotě BI se preparát rychle propaloval a tím pádem snímek tmavl a na pořízení kvalitního snímku byla k dispozici velmi krátká doba. Nebýt korekce za pomoci změny poměru jasu a kontrastu, některé snímky by byly nepoužitelné. Už na výřezech snímků 16a – 16f je vidět, že poměr jasu a kontrastu je jiný a každý snímek má úplně jiný odstín. Dále bylo cílem této kapitoly proměřit závislost velikosti stopy na intenzitě paprsku. Z konzultací a předchozích měření byla očekávána závislost, která bude mít lokální maximum v hodnotě, která byla vypočtena samotným softwarem mikroskopu. Z grafu je zřejmé, že při vyšších hodnotách intenzity paprsku (BI) je velikost stopy (SZ) 2x – 3x větší, než je ideální velikost. S klesající hodnotou intenzity paprsku nejdříve klesá velikost stopy až k minimu. Při dalším snižování BI už stopa opět roste, ale ne až k takovým hodnotám, jakých nabývala při vysokém BI. Myslíme si, že pro práci s replikami je vypočtená ideální hodnota dostačující
k vykreslení
malých
částí
organel
a
různých
transmembránových proteinů, při hodnotách BI nad 12 což jsou snímky 16a, b už byl preparát velmi rychle vypalován. Při hodnotách nižších, řekněme pod BI 6, což jsou snímky 16e, f jsme nepozorovali žádné 89
významné zhoršení snímku oproti stavu s ideální velikostí stopy, jen je potřeba zmenšit poměr jasu a kontrastu. Hodnota velikosti stopy (v podstatě i intenzity paprsku) určená naším měřením, se shodovala s hodnotou vypočtenou samotným mikroskopem.
6.5. Porovnání snímků z TEM a STEM detektoru Snímky pořízené transmisním elektronovým mikroskopem jsou stále lepší co do rozlišení a dosahují i většího zvětšení. Jak je vidět na snímku 17b, TEM lépe vykresluje detaily, jednak kvůli většímu urychlovacímu napětí a také kvůli tomu, že je k tomu technicky lépe uzpůsoben. STEM
detektor
je
dostatečnou
náhradou,
pokud
chceme
pozorovat organely nebo části, které jsou dobře viditelné při menším zvětšení. Avšak pozorovat třeba detaily jaderných pórů je zde již velmi obtížné až nemožné. Nicméně poměr ceny a kvality je, pokud nechceme nějaké snímky s vysokým prostorovým rozlišením, rozhodně lepší pro skenovací mikroskop s přídavným STEM detektorem. Fotografie ze STEM detektoru, které jsou vidět na snímku 17a mají maximální možné zvětšení (bereme v potaz i to, že při tomto zvětšení šel snímek dobře doostřit a nevypaloval se) dosažitelné mikroskopem MIRA. Ačkoliv byly nafoceny i snímky s větším zvětšením, ale jejich vykreslení detailů nebylo tak dobré jako na tomto snímku. Je to pravděpodobně i tím, že snímání tohoto snímku probíhalo poněkud odlišně. Snímek se nesnímal tak, že se sonda věnovala jednotlivému pixelu určitou dobu podle skenovací rychlosti, ale nyní desetkrát za sebou rychle „proletěla“ jeden řádek bodů. Výsledný snímek je sčítán z oněch deseti snímání. Má to výhody i v tom, že pokud v jednom z deseti skenů zapulzuje obraz, nebo nastane nějaký artefakt, po průměrování je efekt takovýchto poruch neviditelný.
90
6.6. Snímky pořízené za pomoci různých detektorů Při práci s elektronovým mikroskopem se můžeme setkat s různými detektory a přídavnými zařízeními. Každý z detektorů je vhodnější pro práci s jiným preparátem nebo za jiných podmínek. Klasický snímek z SE detektoru, jako vidíme na snímku 16a, umožňuje práci s mnoha druhy preparátů pokovených i nepokovených. Za použití doplňkového zařízení lze s jeho pomocí sledovat i preparáty obsahující vodu (Peltiérův stolek). Při práci s tímto detektorem se objevuje nejméně problémů, práce s ním je velmi pohodlná a rychlá. Na snímku 18b je pak vidět snímek pořízený BSE detektorem. Tento detektor je vhodný pro pozorování preparátů, kde je třeba pozorovat materiálový kontrast. Na snímku 18c je použit InBeam SE detektor. Na tomto snímku bylo použito jeho snímání FE repliky a je vidět, že mnoho informací neposkytuje. Pokud však použijeme preparát jako pro normální SE detektor, dostaneme velice kvalitní snímky. Snímek 16d se vyznačuje nízkým vakuem při snímání. S tímto typem detektoru jsme měli jen omezenou možnost se v rámci své práce seznámit. Na snímku 18e vidíme fotografii pořízenou STEM detektorem a na snímku 18f transmisním elektronovým mikroskopem. Srovnání těchto snímků proběhlo v předchozí kapitole. Snad je jen třeba říct, že práce s STEM detektorem je na skenovacím mikroskopu poměrně náročná a na rozdíl od SE detektoru vyžaduje určitý cvik.
91
7. Závěr Záměrem práce bylo využít různých (modifikací) detektorů skenovacího elektronového mikroskopu pro pozorování specifických biologických preparátů. Většina snímání probíhala detektorem prošlých elektronů a první modifikací bylo srovnání metody dark field a bright field. Zde bylo zjištěno, že tyto metody vznikají jiným chodem elektronového paprsku a zároveň bylo dokázáno, že pro pozorování biologických preparátů je lepší metoda bright field. Metoda dark field se jevila v některých případech jako dobrý doplněk pro nějaká hůře čitelná místa na preparátu. Jednou ze změn nastavení mikroskopu byla změna hodnoty urychlovacího napětí. Zde se ukázalo, že pokles urychlovacího napětí zhoršuje práci se snímkem, až ho u hranice 12 kV dělá nevyladitelným. Dále bylo také zjištěno, že hodnota 30 kV je až příliš veliká a při větších zvětšeních hrozí poměrně rychlé znehodnocění preparátu. Kromě toho se ukázalo, že při fixním poměru jasu a kontrastu snímky s klesajícím urychlovacím napětím rychle tmavnou. Dále také byly nasnímány chybné snímky, které obsahovaly artefakty
vzniklé
v přípravě
freeze-etching
replik
jako
vitrifikace,
nečistoty v replice a vypálené zorné pole. Dále snímky zatížené typickou vadou pro SE detektor, a to nabíjením. Za pomoci snímků bylo zjištěno mírné
rozmazání
obrazu
v důsledku
různé
tloušťky
a
plasticity
preparátu. Podmínky týkající se nastavení mikroskopu by neměly být nastaveny a uživatel by se jim měl vyhnout. Měření závislosti velikosti stopy na intenzitě paprsku ukázalo závislost s lokálním maximem (pracovní vzdálenost = 4,84 mm, velikost stopy = 2,4 nm, intenzita paprsku = 9,7). Při porovnání snímku bylo zjištěno velké ovlivnění velikosti stopy pracovní vzdáleností. Čím menší pracovní vzdálenost, tím menší velikost stopy. Na snímcích bylo při větších rozdílech ve velikosti skenovací stopy vidět horší či lepší vykreslení detailů. 92
Byly pořízeny snímky na TEM mikroskopu Morgagni 268 D, které ve srovnání se snímky ze STEM detektoru vyšly lépe. Snímky pořízené STEM detektorem se však svou kvalitou blížily (do jisté hodnoty zvětšení)
snímkům
z TEM.
Při
pozorování
jaderných
membrán
zobrazovaly kvalitně jaderné póry a větší proteiny. Při dalším zvětšení a pozorování vnitřní struktury póru už však nedostačovaly. V této fázi pozorování byl již snímek z TEM kvalitnější a měl o hodně větší vypovídající hodnotu.
93
Seznam použitých zkratek TEM
transmisní elektronová mikroskopie
SEM
skenovací elektronová mikroskopie
STEM
skenovací transmisní elektronová mikroskopie
LVEM
low voltage electron microscopy
TE
transmitted electrons
SE
secondary electrons
BSE
back scattered electrons
LVSTD
low vacuum secondary Tescan detector
FEG
field emission gun
TAO
kyselina tanová
WD
working distance
BI
beam intenzity
SZ
spot size
FE
freeze-etching
2D FFT
2D Fast Fourier transform
DMSO
dimethyl sulfoxid
94
8. Literatura Anastopulos C.: Particle Or Wave: The Evolution of the Concept of Matter in Modern Physics. Princeton University Press: 2008. ISBN 0691-13512-6 Bachmann L., Branton D., Echlin P., Harris J., Hauenstein W., Hoechli
M.,
Kopp
F.,
Moor
H.,
Nermut
M.,
Olive
J.,
Plattner
Mühlethaler H.,
Riehle
K.,
U.,
Nanninga
N.,
Schmitt-Fumian
Werner W., Staehelin L. Andrew, Steere Russell L.: Freeze etching techniques
and
applications.
Société
Francaise
de
Microscopie
skenovací
elektronové
Électronique Paris 1973 Bílý
T.:
Fyzikální
principy
transmisní
a
mikroskopie. Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích (bakalářská práce) Brown B.: Biological membranes. London: Biochemical Society, 1996. ISBN 09-044-9832-8 Bullivant S., Frank J., Hama K., Hayes Thomas L., Luft John H., McHenry Frances A., Pease Daniel C., Salpeter Miriam M.: Advanced techniques in biological electron microscopy. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, rok 1973, ISBN 3-540-06049-9 Bullivant S.: Handbook of charged particle optics (second edition). New York: CRC press Taylor and Francis group, 2009. ISBN 978-1-42004554-3 Buršík J.: Elektronová mikroskopie a její aplikace při studiu látek. Brno: Skripta Bystrický
V.:
Elektrónový
mikroskop.
Slovenskej akadémie vied, 1962.
95
Bratislava:
Vydavatel´stvo
Eichten E., Lane K., Peskin M,: New Tests for Quark and Lepton Substructure. Physical Review Letters [online]. 1983, roč. 50, č. 11. ISSN 0031-9007 Halliday D., Resnick R., Walker J.: Fyzika. Brno: VUTIUM, 2000. ISBN 8-214-1868-0 Kalina T., Pokorný V.: Základy elektronové mikroskopie pro biology. Praha: Karlova Univerzita, 1979. Karlík M.: Úvod do transmisní elektronové mikroskopie. Vyd. 1. Praha: České vysoké učení technické v Praze, 2011. ISBN 3-540-56849-2 Kodíček M., Karpenko V.: Biofysikální chemie. Academia Praha, 2000 Luštinec J., Žárský V.: Úvod do fyziologie vyšších rostlin. Praha: Nakladatelství Karolinum Praha, 2003. Nebesářová J.: Elektronová mikroskopie pro biology. České Budějovice: 2001. elektronická kniha (http://www.paru.cas.cz/lem/book/) Nebesářová J., Vencová M.: "How to Observe Small Biological Objects in Low-Voltage Electron Microscope". Microscopy and Microanalysis 13 (3): 248-249. doi: 10.1017/S143192760708124X. Pauling L.C.: The Nature of the Chemical Bond and the Structure of Molecules
and
Crystals:
an
introduction
to
modern
structural
chemistry. Cornell University Press: 1960. ISBN 0-8014-0333-2 Reimer L.: Scanning electron microscopy: physics of image formation and microanalysis. Berlín: 1985. ISBN 3-540-13530-8 Robinson D.G., Ehlers U., Herken R., Herrmann B., Mayer F., Schurman F. – W.: Methods of preparation for electron microscopy. Springer–Verlag Berlín Heidelberg, 1987 Singer S., Nicholson G.L.: The fluid mosaic model of cell membranes. 1972. Science. 172:720-730
96
Šuškin N.G.: Elektronový mikroskop. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1954. Technický manuál mikroskopu MIRA 3 FEG-SEM, Tescan Vácha M., Fellnerová I., Bičík V., Petrásek R., Šimek V.: Srovnávací fyziologie živočichů. Masarykova univerzta: Brno, 2002 Wilson R.: Astronomy Through the Ages: The Story of the Human Attempt to Understand the Universe. CRC Press: 1997. ISBN 0-74840748-0 Židek O.: Elektronová mikroskopie na biologických vzorcích. Brno: Masarykova Univerzita (bakalářská práce) Vácha M., Fellnerová I., Bičík V., Petrásek R., Šimek V.: Srovnávací fyziologie živočichů. Masarykova univerzta: Brno, 2002 Internetové zdroje www.isibrno.cz/~mih/muzeum/muzeumen.htm http://www.aldebaran.cz/bulletin/2012_32_mic.php http://classes.midlandstech.edu www.tescan.cz http://course1.winona.edu/sberg/ILLUST/nuc-por2b.JPG
97
