BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM SISTEMATIKA MIKROBIA
Oleh: Dr. Enny Zulaikha, MP. M. Andry
FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA
1
TAKSONOMI NUMERIK FENETIK Acara 1 – Klasifikasi Numerik-Fenetik Berdasarkan Data Fenotipik A. Pengantar Taksonomi numerik yang juga dikenal dengan sebutan taksonomi Adansonian (berdasarkan nama ahli sistematika Michael Adanson) didefinisikan sebagai pengelompokan unit taksonomis ke dalam sejumlah taksa dengan metode numerik berdasarkan karakteristik yang dimiliki. Taksonomi numerik didasarkan atas lima prinsip utama, yakni: 1. Taksonomi yang ideal adalah taksonomi yang mengandung informasi terbesar yaitu yang didasarkan atas sebanyak-banyaknya karakter. 2. Masing-masing karakter diberi nilai yang setara (a priori) dalam mengkonstruksi takson yang bersifat alami. 3. Tingkat kedekatan antara dua strain/OTU (operational taxonomical unit) merupakan fungsi similaritas yang dimiliki bersama. 4. Taksa yang berbeda dibentuk atas sifat yang dimiliki. 5. Similaritas tidak bersifat filogenetis melainkan bersifat fenetis. Tujuan utama taksonomi numerik adalah untuk menghasilkan suatu klasifikasi yang bersifat teliti, reprodusibel, serta padat informasi. Aplikasi taksonomi numerik dalam konstruksi klasifikasi biologis memungkinkan terwujudnya sirkumskripsi takson berdasarkan prinsip yang mantap dan bukan sekedar klasifikasi yang bersifat subjektif belaka. Teknik klasifikasi meliputi empat tahapan, yaitu: 1. Strain mikrobia (n) yang akan diklasifikasikan dikoleksi lalu ditentukan karakter fenotipiknya dalam jumlah besar (t) yang mencakup sifat yang tertera pada Tabel 1.1. Data yang diperoleh disusun dalam suatu matriks n x t. 2. Strain mikrobia diklasifikasikan berdasarkan nilai similaritas atau disimilaritas yang dihitung dari data n x t. 3. Strain yang mirip akan dimasukkan ke dalam satu kelompok dengan menggunakan algoritma pengklasteran (clustering algorithm). 4. Kelompok yang dibentuk secara numerik lalu dipelajari dan karakter yang bersifat membedakan (separating character) dipilih diantara data dalam matriks untuk selanjutnya digunakan dalam dentifikasi. B. Cara Kerja Tahapan kerja dalam klasifikasi numerik-fenetik terdiri dari (1) pemilihan strain uji, (2) pemilihan jenis pengujian, (3) pencatatan hasil pengujian, (4) data coding, (5) analisis komputer, dan (6) interpretasi hasil (Priest & Austin, 1993). Namun demikian, dalam praktikum ini kita akan menggunakan data hasil pengujian dari artikel penelitian yang
2
terdapat pada jurnal ilmiah dalam bentuk tabel n x t. Dengan demikian, kita telah melewati tahapan kerja 1–3 dan langsung menuju tahapan data coding dan seterusnya. Tabel 1.1. Kelompok karakter yang digunakan dalam taksonomi numerik bakteri (Priest & Austin, 1993). No
Kelompok Karakter
1
Morfologi kolonial
2
Morfologi selular
3
Sifat pertumbuhan
4
Sifat biokimia
5
7
Resistensi terhadap antibiotik Kemampuan penggunaan senyawa kimia sebagai satusatunya sumber C Sifat serologis
8
Sifat kemotaksonomis
9 10
Sifat genetik Phage typing
6
Jenis Karakter Bentuk dan ukuran koloni, pigmentasi larut/tidak larut/ fluoresens. Sifat pengecatan, bentuk & ukuran sel, motilitas, ada/tidak nya flagela, ada/tidaknya spora. Bentuk-bentuk pertumbuhan pada medium cair, kekeruhan, aerobsis/anaerobsis, kebutuhan vitamin, kemampuan tumbuh pada medium salinitas tinggi. Kemampuan fermentasi/oksidasi karbohidrat, kehadiran enzim katalase & oksidase, penghasilan asam, indol, & gas H2S. Kemampuan untuk tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik. Kemampuan tumbuh pada medium minimal dengan glukosa/alanin/sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon Ada/tidaknya reaksi aglutinasi terhadap antiserum spesifik Kehadiran komponen sub-selular tertentu, seperti peptidoglikan, menakuinon, asam mikolat. Kandungan G+C pada DNA Ada/tidaknya pola phage typing tertentu
1. Penelusuran Sumber Data Dalam praktikum ini, data untuk klasifikasi numerik-fenetik didapatkan melalui hasil penelusuran artikel ilmiah. Artikel ilmiah tersebut dapat dicari dari internet melalui Google Search dengan mengetikan kata-kata kunci terkait klasifikasi numerik fenetik seperti contohnya “numerical taxonomy of...” atau “numerical classification of...” Salah satu contoh artikel dapat dilihat pada West et al. (1986) yang mempelajari klasifikasi spesies anggota genus Vibrio yang diisolasi dari perairan. Data yang terdapat pada artikel tersebut selanjutnya akan dijadikan contoh pada panduan praktikum ini. Setelah mendapatkan artikel jurnal, telusuri tabel n x t yang terdapat di dalam artikel tersebut. Walaupun sering tidak disebut sebagai tabel n x t, namun tabel n x t dapat terlihat dari cirinya yang mengandung informasi mengenai strain-strain mikrobia (n) serta jenis karakter yang diujikan (t). Karakter yang terkandung dalam tabel n x t pada umumnya akan dikelompokan seperti pada Tabel 1.1.
3
2. Konstruksi Tabel n x t Berdasarkan tabel n x t yang diperoleh dari artikel jurnal penelitian, selanjutnya kita membuat tabel n x t sendiri. Tabel n x t dapat dibuat dengan program Microsoft Excel (MS Excel). Pada MS Excel, strain (n) dimasukan sebagai kolom dan karakter pengujian (t) dimasukan sebagai baris (Gambar 1.1.). Pengkodean pada tabel n x t menggunakan sistem biner, yakni notasi “1” dan “0”. Notasi “1” diberikan apabila ada kehadiran suatu sifat dan notasi “0” diberikan untuk ketidakhadiran suatu sifat. Jika dilihat pada Gambar 1 tersebut, kemampuan V. fluvialis untuk dapat tumbuh pada medium dengan kandungan NaCl 6% menjadikan spesies tersebut mendapatkan notasi “1” pada karakter “Pertumbuhan 6% NaCl”. Sebaliknya, V. fluvialis tidak dapat tumbuh pada medium dengan kandungan NaCl 0% sehingga membuatnya mendapatkan notasi “0” untuk sifat tersebut. Dalam laporan tertulis atau publikasi ilmiah, penggunaan notasi “1” dan “0” pada n x t sebagai indikasi kehadiran dan ketidakhadiran suatu sifat pada suatu strain terkesan kurang lazim. Pada umumnya, notasi “+” dan “–“ digunakan sebagai pengganti “1” dan “0”. Namun demikian, notasi “1” dan “0” pada n x t dimaksudkan untuk kepentingan analisis menggunakan program komputer, karena program tersebut tidak dapat mengenali notasi “+” dan “–“.
Gambar 1.1. Contoh tabel n x t Perlu diketahui bahwa pemilihan spesies dalam konstruksi tabel n x t sebaiknya mencakup type strain untuk spesies tersebut. Dengan kata lain, sangat disarankan apabila data yang digunakan juga memiliki hasil pengujian untuk type strain. Suatu type strain merupakan strain yang mewakili suatu spesies atau dengan kata lain type strain merupakan pemilik nama spesies. Kehadiran suatu type strain dalam proses konstruksi dendrogram berfungsi sebagai acuan bagi strain-strain lainnya yang memiliki kesamaan nama spesies dengan type strain, sehingga dapat lebih meyakinkan posisi strain-strain tersebut dalam suatu dendrogram. 3. Konstruksi Dendrogram Dengan Program MVSP 3.1 (Kovach, 2007) Konstruksi dendrogram dengan MVSP 3.1 membutuhkan file input dalam format .mvs. File tersebut dapat dihasilkan menggunakan program Programmer’s File Editor (PFE) atau Notepad. Kedua program tersebut memiliki kalimat perintah yang sama, sehingga dalam penjelasan ini hanya akan diterangkan mengenai satu program saja yakni PFE. Pada program PFE, buka file baru “New” dan akan tampil sebuah layar. Pada layar tersebut ketik *L <jumlah karakter> <jumlah strain>. Sebagai contoh,
4
apabila kita ingin mengkonstruksi dendrogram 10 spesies dengan 50 karakter, maka kita akan menuliskan *L 50 10 pada baris pertama layar. Setelah itu, copy tabel n x t dari MS Excel ke dalam layar PFE. Namun sebelum itu, tabel n x t harus sedikit dimodifikasi agar dapat terbaca oleh program PFE dan MVSP. Modifikasi yang dilakukan meliputi penambahan baris dibawah nama OTU dan kolom disamping jenis karakter (Gambar 2). Penambahan ini dilakukan karena program PFE dan juga MVSP akan memperlakukan spasi sebagai pemisah antar dua kategori. Apabila kita tidak menambahkan simbol pengganti karakter atau OTU, maka sebagai contoh “V. fluvialis” akan dianggap sebagai dua kategori yakni “V.” dan “fluvialis”. Setelah modifikasi selesai dilakukan, maka tabel n x t selanjutnya di-copy ke program PFE. Perlu diketahui bahwa hanya character states dan simbol karakter yang di-copy-kan ke PFE (kotak abu muda dan abu tua pada Gambar 1.2.).
(a)
(b) Gambar 1.2. (a) Tabel n x t awal, dan (b) modifikasi berupa penambahan baris simbol strain [a, b, c] dan kolom simbol karakter [1, 2, 3, 4, 5]. Hasil copy akan terlihat seperti berikut: *L 5 3 a b 1 0 0 2 1 1 3 1 1 4 0 0 5 0 0
c 0 1 0 0 0
Simpan file tersebut dalam format .mvs dengan memberikan tambahan “.mvs” pada akhir nama file dalam menu save. File .mvs tersebut selanjutnya dapat dibuka dengan program MVSP 3.1. Selanjutnya, masuk ke program MVSP 3.1 dengan membuka aplikasi mvspw. Pada MVSP, klik File → Open dan pilih file .mvs yang tersimpan.
5
Ketika terbuka, MVSP akan menampilkan sebuah layar tambahan mengenai jumlah variabel dan jumlah sampel dari file .mvs yang kita masukan. Pada program MVSP, kita dapat mengubah kembali nama OTU/sampel yang sebelumnya telah diubah menjadi simbol [a, b, c] dengan menu Data → Edit Data. Pengubahan data pada menu tersebut dapat menerima spasi, namun tidak dapat mencetak miring sebagaimana yang seringkali dilakukan terhadap nama suatu spesies. Setelah semua simbol OTU diubah menjadi nama spesiesnya, kita dapat menutup layar Edit Data tersebut dan memulai analisis klaster. Analisis klaster dilakukan melalui menu Analyses → Cluster Analysis. Pada layar Cluster Analysis, kita dapat menentukan jenis perhitungan indeks similaritas dan analisis klaster yang diinginkan. Dalam praktikum ini kita akan mencoba menggunakan dua jenis perhitungan indeks similaritas (SSM dan SJ) dan metode pengklasteran average linkage / UPGMA. Pada metode pengklasteran, kita juga dapat memilih single linkage / nearest neighbour atau complete linkage / farthest neighbour. Setelah selesai memilih perhitungan indeks similaritas dan metode pengklasteran pada submenu Options, kita dapat memilih output analisis pada menu Advanced. Pada submenu Advanced, kita dapat menentukan penampilan hasil analisis pada kolom result to display. Nyalakan pilihan Similarity/distance matrix, Clustering report, dan Text dendrogram. Setelah semuanya selesai, maka klik OK. Hasil analisis akan memunculkan dua layar, yakni layar pertama yang berisikan matriks similaritas dan analisis klaster serta layar kedua yang menampilkan dendrogram. Untuk memudahkan analisis selanjutnya, disarankan untuk meng-copy seluruh isi layar pertama yang menyerupai layar Excel ke program MS Excel. Gambar dendrogram dapat dijadikan file gambar (image file) dengan File → Export. 4. Analisis Korelasi-Kofenetik Analisis korelasi-kofenetik dilakukan untuk melihat tingkat akurasi suatu dendrogram yang merepresentasikan matriks similaritas antar OTU. Analisis ini membandingkan dua jenis matriks similaritas, yakni matriks similaritas awal (unsorted) dan matriks similaritas yang diturunkan dari dendrogram (sorted). Analisis ini dapat dilakukan dengan program MS Excel. Sebelum mengisikan nilai-nilai dari kedua matriks similaritas, kita perlu membuat pasangan OTU terlebih dahulu. Jumlah kemungkinan pasangan OTU yang dapat dibentuk dari n-OTU dijabarkan dengan rumus kombinasi:
Pada contoh diatas, kita dapat menghasilkan 3 jenis kemungkinan pasangan dari total 3 OTU, yakni [a,b], [a,c], dan [b,c]. Setelah semua kemungkinan pasangan dituliskan, masukan nilai untuk kolom unsorted, yakni nilai similaritas dari matriks similaritas awal
6
dan kemudian nilai untuk kolom sorted yang berasal dari dendrogram / analisis klaster. Dari hasil MVSP kita memperoleh matriks similaritas: V. fluvialis V. fluvialis 1.000 V. furnisii 1.000 V. natriegens 0.500
V. furnisii 1.000 0.500
V. natriegens
1.000
dan analisis klaster: Node Group 1 1 V. fluvialis 2 Node 1
Objects Group 2 Simil. in group V. furnisii 1.000 2 V. natriegens 0.500 3
Berdasarkan matriks similaritas tersebut, kita memasukan nilai unsorted. Dengan demikian, pasangan [a,b] yang dalam hal ini [V. fluvialis, V. furnisii] memiliki nilai 1.000. Hal yang sama untuk pasangan [a, b] juga sama pada analisis klaster, sehingga kolom sorted untuk pasangan [a,b] bernilai 1.000. Hal yang perlu diperhatikan, khususnya pada tabel analisis klaster adalah pada nomor 2, yakni penggabungan Node 1 dengan V. natriegens. Dalam hal ini, masing-masing komponen dari Node 1, yakni a dan b akan berpasangan dengan V. natriegens ([c]) pada nilai 0.500. Hal ini berarti kombinasi [a,b] dengan [c] akan menghasilkan [a,c] dan [b,c] yang keduanya memiliki nilai similaritas 0,500. Setelah semua komponen nilai dimasukan, maka akan terbentuk tabel seperti: OTU Unsorted Sorted ab 1 1 ac 0.5 0.5 bc 0.5 0.5 ... Dari tabel tersebut, kita dapat menghitung nilai korelasi menggunakan fungsi CORREL. Indeks korelasi yang diterima adalah ≥0,7 atau ≥70%. Semakin rendah nilai korelasi berarti dendrogram yang terbentuk semakin tidak mewakili matriks similaritas yang menjadi dasar konstruksinya. 5. Penampilan Hasil Data dan hasil yang diperoleh dari praktikum ini meliputi: (1) tabel n x t, (2) matriks similaritas, (3) analisis klaster, (4) dendrogram, dan (5) analisis korelasi-kofenetik. Perlu diingat bahwa setiap entry pada tabel n x t yang sebelumnya dimasukan dengan notasi “1” dan “0” perlu diganti dengan notasi “+” dan “–“ untuk pelaporan hasil. Perubahan ini dapat dilakukan pada MS Excel menggunakan fungsi Find/Replace (ctrl+F). Seluruh data dan hasil dimuat dalam bab hasil pada laporan praktikum.
7
Acara 2 – Klasifikasi Numerik-Fenetik Berdasarkan Profil Sidik Jari Molekular A. Pengantar Selain data fenotipik, data berupa profil sidik jari molekular (molecular fingerprints) juga dapat digunakan dalam studi taksonomi mikrobia. Profil yang digunakan dapat berasal dari DNA, RNA, atau protein. Studi klasifikasi menggunakan profil sidik jari molekular termasuk ke dalam studi kemosistematik bersama dengan analisis komponen selular lainnya (Priest & Austin, 1993). Teknik yang paling umum digunakan dalam studi klasifikasi berdasarkan profil sidik jari molekular adalah restriction fragment length polymorphisms (RFLP). Prinsip dasar dari penggunaan RFLP adalah adanya kesamaan situs restriksi antara satu mikroorganisme dengan mikroorganisme lainnya yang dapat dikenali oleh enzim restriksi endonuklease tertentu. Hal ini berarti bahwa distribusi situssitus restriksi tersebut dapat memberi gambaran mengenai kemiripan antara satu mikroorganisme dengan lainnya secara molekular. B. Cara Kerja Seperti halnya pada praktikum acara 1, data yang dipakai dalam praktikum acara 2 ini diperoleh dari artikel penelitian yang terdapat pada jurnal ilmiah dalam bentuk elektroforegram (foto elektroforesis). 1. Penelusuran Sumber Data Data yang digunakan dalam praktikum ini berupa elektroforegram sidik jari (fingerprint) molekular. Data fingerprint tersebut dapat berupa hasil ribotyping, RFLP, RAPD, dan lainnya. Elektroforegram dari suatu artikel jurnal dapat di-crop menggunakan program PDF reader seperti Adobe Reader melalui menu Tools → Select & Zoom → Snapshot Tool. Buat file gambar (image file) format JPEG atau PNG dari elektroforegram tersebut dengan memblok elektroforegram yang diinginkan dan copy (ctrl+C) ke program Paint. 2. Pembuatan Diagrammatic Representative Diagrammatic representative merupakan sebuah gambaran skematis yang mewakili elektroforegram yang dianalisis. Penggunaan diagrammatic representative ini barfungsi untuk mempertegas kehadiran atau ketidakhadiran suatu band dalam elektroforegram. Kejelasan mengenai hadir atau tidaknya sebuah band merupakan hal yang penting karena band tersebut diasumsikan sebagai karakter dalam data coding. Pembuatan diagrammatic representative dapat dilakukan dengan program photo editor seperti Corel Draw, Adobe Photoshop, atau Paint Shop Pro. Secara umum, tahapan pembuatannya meliputi input gambar, penambahan layer transparan, dan menggambarkan suatu garis pada layer transparan tersebut yang berpandu pada band elektroforegram dibawahnya. Dalam praktikum ini program Paint Shop Pro (PSP) akan digunakan untuk pembuatan diagrammatic representative ini. Pertama, buka program PSP dan masukan file gambar elektroforegram yang telah dibuat sebelumnya melalui
8
menu File → Open. Setelah gambar elektroforegram muncul, akan terdapat suatu kotak bertuliskan Layer pada sisi sebelah kanan. Apabila kotak ini tidak muncul, kita dapat memunculkannya melalui ikon Toggle Layer Palette pada sisi atas, ikon kedua dari kanan. Pada layer palette tersebut, gambar yang kita masukan sebelumnya dikategorikan sebagai Background. Kita dapat menambahkan layer baru dengan menekan ikon Add New Layer yang terletak pada pojok kiri bawah layer palette. Sebuah layer baru yang muncul akan diberi nama Layer 1 secara otomatis dan terletak di atas layer Background. Klik ikon Layer 1 untuk mengaktifkannya dan Pada Layer 1 inilah kita akan membuat diagrammatic representative dari elektroforegram. Setelah memilih Layer 1, aktifkan control palette dengan menekan ikon Toggle Control Palette yang terletak 3 ikon di sebelah kiri Toggle Layer Palette. Menu control palette berfungsi untuk mengatur jenis, ketebalan, bentuk, dan ukuran brush tip yang akan digunakan untuk mewarnai Layer 1 berdasdarkan cetakan yang ada pada elektroforegram. Sebelum mengatur apapun yang ada pada control palette, aktifkan Paint Brushes yang terletak pada tool palette (menu di pojok kiri). Pemilihan warna dapat dilakukan pada color palette (menu di pojok kanan). Kedua menu tersebut masing-masing dapat diaktifkan melalui Toggle Tool Palette dan Toggle Color Palette. Menu Control Palette terdiri atas dua submenu, yakni Tool Controls dan Brush Tip. Untuk sementara, abaikan dahulu submenu Tool Controls dan masuk ke submenu Brush Tip. Pada submenu Brush Tip terdapat pilihan Shape, Size, Opacity, Hardness, Density, dan Step yang masing-masing berfungsi untuk mengatur jenis kuas, ukuran kuas, ketebalan warna, ketegasan bentuk kuas, kepadatan warna, dan gradasi kuas. Hasil pengaturan enam parameter ini langsung ditampilkan pada layar di kiri atas submenu Brush Tip. Sebagai contoh, pengaturan Brush Tip yang digunakan meliputi Shape: Horizontal, Opacity: 25, Hardness: 50, Density: 100, dan Step: 1. Size yang digunakan bergantung pada ukuran image file yang digunakan. Sebelum mulai membuat diagrammatic representative, sebaiknya kita mengujikan hasil pengaturan pada submenu Brush Tip untuk melihat kecocokannya langsung pada Layer 1. Hasil pengujian kemudian dapat dihapus dengan mengaktifkan ikon Eraser pada tool palette. Bentuk dan ukuran Eraser juga diatur pada menu Control Palette yang sama dengan Brush Tip. Hasil penggambaran dapat dilihat pada Gambar 2.1. Setelah penggambaran selesai dilakukan, simpan file tersebut (PSP akan secara otomatis menyimpannya dalam format .psp). File .psp ini juga dapat dibuka dengan program image viewer seperti ACDSee. Diagrammatic representative yang ditampilkan adalah hasil penggambaran yang dilakukan tanpa menyertakan background foto elektroforegram.
9
Gambar 2.1. (a) Elektroforegram awal yang dijadikan latar belakang/background dan (b) hasil penggambaran yang berpandu pada latar belakang tersebut. Dengan demikian, kita dapat menghilangkan foto elektroforegram dengan meng-klik ikon Background pada Layer Palette dan kemudian Delete. Hasilnya hanya akan tersisa pita-pita berwarna hasil penggambaran sebelumnya (Gambar 2.2). Simpan kembali file ini dalam format .jpg (gunakan menu Save As) dengan nama lain agar tidak mengganti file sebelumnya.
Gambar 2.2. (a) Elektroforegram dan (b) diagrammatic representative yang dihasilkan dari elektroforegram tersebut. 3. Data Coding dan Analisis Diagrammatic representative yang dihasilkan merupakan sumber untuk data coding. Dalam hal ini, setiap pita yang tergambarkan pada diagrammatic representative merupakan karakter, sehingga total seluruh pita dari seluruh strain mencerminkan jumlah karakter (t) pada tabel n x t. Konversi diagrammatic representative menjadi tabel n x t dapat dilakukan secara intuitif dengan melihat kesejajaran pita antar strain dan menggolongkan pita-pita yang sejajar sebagai satu karakter (Gambar 2.3). Namun demikian, apabila jumlah pita terlalu banyak maka diperlukan garis bantu untuk melihat kesejajaran antar pita. Garis bantu tersebut dapat dibuat pada program Paint. Buka file gambar diagrammatic representative dalam format .jpg dengan program Paint dan klik ikon Line yang terletak pada bagian atas. Setelah itu buat garis dari ujung kiri ke ujung kanan gambar dimulai dari pita teratas. Pita-pita yang bersinggungan dengan garis tersebut dinyatakan sejajar dan menempati karakter yang sama.
10
Gambar 2.3. Konversi diagrammatic representative menjadi tabel n x t. Tabel n x t yang telah dibuat selanjutnya dianalisis secara numerik-fenetik sama seperti pada analisis data fenotipik. Analisis dilakukan menggunakan program MVSP 3.1 (Kovach, 2007) dengan indeks similaritas SSM dan SJ serta algoritme pengklasteran UPGMA. 4. Interpretasi Hasil Hasil analisis numerik-fenetik data fingerprint molekular ini sekilas terlihat sama dengan data fenotipik, yakni terdiri atas matriks similaritas, analisis klaster, dan dendrogram. Akan tetapi, perlu diperhatikan bahwa kaidah yang diterapkan pada data fenotipik tidak harus diterapkan pada data fingerprint ini. Salah satu syarat seperti digunakannya minimal 50 karakter pada data fenotipik tidak perlu diterapkan pada data fingerprint. Hal ini didasarkan pada fakta bahwa profil fingerprint yang ada dipandang hanya sebagai salah satu karakter saja dan tabel n x t yang dikonstruksi merupakan turunan dari satu karakter tersebut.
11
TAKSONOMI FILOGENETIK Acara 3 – Klasifikasi Molekular Filogenetik Berdasarkan Gen 16S rRNA A. Pengantar Klasifikasi molekular filogenetik merupakan klasifikasi yang disusun dengan mempertimbangkan jalur evolusi setiap organisme yang dikaji. Hal ini berbeda dengan klasifikasi fenetik yang hanya melihat hubungan antar organisme berdasarkan karakter yang ada pada saat ini (Priest & Austin, 1993). Dalam prosesnya, klasifikasi molekular filogenetik menggunakan data berupa urutan (sequence) nukleotida pada DNA atau asam amino pada protein. Sequence nukleotida yang digunakan dalam klasifikasi molekular filogenetik harus merupakan sequence yang diwariskan langsung oleh nenek moyang (homolog) serta memiliki kesamaan sejarah evolusi. Sebuah sequence dapat disebut sebagai marker molekular apabila memenuhi persyaratan berupa: (1) terdistribusi pada seluruh organisme, (2) memiliki kesetaraan fungsi pada seluruh organisme, dan (3) memegang peranan vital bagi kehidupan organisme. Hal ini menjadikan marker molekular merupakan sequence yang tepat untuk digunakan dalam studi klasifikasi filogenetik. Gen 16S rRNA merupakan salah satu contoh marker molekular karena terdapat pada organisme baik yang berada pada domain Bacteria, Archaea, serta Eukarya. Saat ini, informasi mengenai sequence gen 16S rRNA sudah sangat banyak tersedia pada database internasional dan juga sudah dijadikan standar penetapan suatu spesies baru dalam studi taksonomi. Pada praktikum ini kita akan mencoba mengklasifikasikan sejumlah bakteri dengan cara merekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sequence gen 16S RNA yang dimiliki. B. Cara Kerja 3.1.1. Persiapan Data Data yang digunakan dalam klasifikasi berbasis molekular filogenetik adalah berupa urutan (sequence) nukleotida atau asam amino. Kedua jenis sequence ini umumnya dapat diperoleh dari hasil sequencing DNA/protein maupun dari sequence database internasional yang tersedia di internet. Untuk kemudahan dalam praktikum ini, kita akan menggunakan cara kedua, yakni mengunduh sequence nukleotida/asam amino dari internet. Saat ini sudah banyak sekali situs yang memfasilitasi hal tersebut. Situs GenBank, DDBJ, serta EMBL merupakan situs dimana pencarian sequence nukleotida/asam amino umumnya dilakukan. Dalam acara praktikum ini, kita akan mencoba mengunduh data melalui GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) dan untuk selanjutnya sequence DNA akan digunakan sebagai contoh persiapan data. Pada GenBank kita dapat mencari sequence DNA berdasarkan nama gen, spesies pemilik gen, atau accession number pada kolom search yang tersedia. Accession number
12
merupakan penanda/identitas dari setiap sequence DNA yang telah disimpan pada situs tersebut. Pada umumnya accession number tertulis pada artikel publikasi ilmiah yang penelitinya telah menyumbangkan hasil sequencing-nya ke database yang ada. Pencarian pada menu search di GenBank terdiri dari banyak menu sub-pencarian untuk memudahkan penelusuran data, namun dalam praktikum ini kita akan lebih fokus pada pencarian dengan menu Nucleotide, Protein, dan Genome. Sebagai contoh, apabila kita ingin melakukan pencarian gen 16S rRNA bakteri Escherichia coli maka kita dapat melakukan salah satu dari hal berikut: 1. Melakukan penelusuran pustaka, misalnya pada artikel jurnal untuk mendapatkan accession number. Sebagai contoh, Escherichia coli ATCC 11775T pada Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Brenner et al., 2005) memiliki accession number X80725. Accession Number ini dapat diketikan pada kolom search nucleotide. Cara ini merupakan pencarian yang cukup spesifik karena setiap sequence dari setiap jenis organisme memiliki accession number tersendiri. 2. Melakukan penelusuran pada situs List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (LPSN, http://www.bacterio.cict.fr/). Penelusuran melalui situs ini khusus untuk pencarian sequence bakteri dan archaea saja. Informasi yang diberikan mengenai suatu genus/spesies meliputi type species, type strain, tahun ditemukan, dan publikasi (valid/efektif) terkait genus/spesies tersebut. 3. Melakukan penelusuran pada kolom search nucleotide di GenBank dengan mengetik kata kunci, seperti “Escherichia coli 16S rRNA”. Cara ini kurang spesifik karena akan menghasilkan sejumlah daftar yang berisikan berbagai macam spesies bakteri yang mengandung sequence gen 16S rRNA dan kita harus mencarinya satu per satu. 4. Melakukan penelusuran pada kolom search genome di GenBank dan kemudian mengetik nama spesies yang kita inginkan. Umumnya hasil penelusuran meliputi sejumlah daftar complete genome dari spesies yang dicari. Kita dapat mencari gen yang diinginkan dalam daftar complete genome tersebut. Cara ini cukup memakan waktu, namun kita dapat menelusuri berbagai jenis gen dari spesies tersebut. Contoh Hasil pencarian dengan accession number X80725 akan ditampilkan sebagai berikut: E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA GenBank: X80725.1 FASTA Graphics LOCUS X80725 1450 bp DNA linear BCT 29-MAR-1996 DEFINITION E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA. ACCESSION X80725 VERSION X80725.1 GI:1240022
13
KEYWORDS 16S ribosomal RNA; 16S rRNA gene; 16S small subunit ribosomal RNA. SOURCE Escherichia coli DSM 30083 ORGANISM Escherichia coli DSM 30083 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia. REFERENCE 1 AUTHORS Cilia,V., Lafay,B. and Christen,R. TITLE Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level JOURNAL Mol. Biol. Evol. 13 (3), 451-461 (1996) PUBMED 8742634 REFERENCE 2 (bases 1 to 1450) AUTHORS Lafay,B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (26-JUL-1994) B. Lafay, CNRS & Universite Paris 6,Station Zoologique, Observatoire Oceanologique, Villefranche Sur Mer, 06230, FRANCE FEATURES Location/Qualifiers source 1..1450 /organism="Escherichia coli DSM 30083" /mol_type="genomic DNA" /strain="ATCC 11775T" /db_xref="taxon:866789" gene 1..1450 /gene="16S rRNA" rRNA 1..1450 /gene="16S rRNA" /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 agtttgatca tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg 61 taacaggaag cagcttgctg ctttgctgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga 121 aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 181 agcacaaaga gggggacctt agggcctctt gccatcggat gtgcccagat gggatta...
14
Tulisan diatas mengandung informasi mengenai jenis sequence, asal sequence, produk yang dihasilkan, dan sequence itu sendiri. Dalam contoh ini jenis sequence adalah gen 16S rRNA yang berasal dari Escherichia coli ATCC 11775T. Gen ini akan menghasilkan produk berupa RNA ribosomal (rRNA). Informasi mengenai hasil pengkodean dari sequence dapat dilihat pada FEATURES. Sequence dari DNA itu sendiri yang dituliskan per 10 nukleotida pada kolom ORIGIN. Sequence ini selanjutnya dapat diunduh dalam bentuk FASTA dengan cara meng-klik link FASTA pada baris ketiga, dan akan muncul: E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA GenBank: X80725.1 GenBank Graphics >gi|1240022|emb|X80725.1| E.coli (ATCC 11775T) gene for 16S rRNA AGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGG TAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGA AACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCA AGCACAAAGAGGGGGACCTTAGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTA... Kedua jenis data ini (informasi sequence dan sequence FASTA) dikompilasi ke masingmasing arsip untuk membuat database sendiri. 1. Sequence Alignment dengan Program ClustalX 2.1 (Larkin et al., 2001) Alignment bertujuan untuk menata sequence agar satu sama lain diletakkan sesuai dengan posisi homologi antar sequence. Hanya berdasarkan alignment inilah kita dapat membandingkan antar sequence gen 16S rRNA dari masing-masing strain mikrobia yang akan diklasifikasikan. Alignment menggunakan program ClustalX dilakukan dengan mempersiapkan data sequence dalam format FASTA. Dataset sejumlah sequence yang telah didapatkan dikumpulkan terlebih dahulu ke dalam 1 file Notepad dengan awalan dari setiap sequence diberikan tanda “>”. Contohnya dapat dilihat pada sequence berikut: >Allochromatium vinosum DSM 180 agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaa... >Chlorobium luteolum DSM 273 aggaaagcggcttcggccgggagtacttggcgcaagggtgagtaaggcatagg... >Chloroflexus aurantiacus J-10-fl aaaggaggtgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgacttcg... Penamaan dalam pembuatan dataset sequence ini juga perlu diperhatikan. Disarankan untuk menyingkat nama dari setiap sequence yang ada karena program ClustalX akan secara otomatis memotong karakter nama apabila melebihi 30 karakter. Selain itu, hasil alignment ClustalX yang akan digunakan dalam program Phylip (.phy) juga akan secara otomatis memotong karakter nama apabila melebihi 10 karakter. Hal ini akan membingungkan apabila pembeda antar nama sequence satu dengan lainnya terletak pada
15
posisi karakter >10, karena ketika dipotong akan menghasilkan nama yang sama antar sequence satu dengan lainnya. Dengan demikian, sebaiknya kita membuat daftar baru (dengan MS Word atau Notepad) yang berisi rincian nama sequence beserta singkatannya. Singkatan nama ini yang akan kita gunakan dalam dataset yang akan diproses dalam ClustalX. Contoh dataset diatas setelah namanya disingkat akan menjadi: >AvinDSM180 agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaa... >ClutDSM273 aggaaagcggcttcggccgggagtacttggcgcaagggtgagtaaggcatagg... >ChaurJ-10-fl aaaggaggtgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgacttcg... Perlu diperhatikan bahwa pemberian nama tidak boleh mengandung spasi. Penyingkatan nama sequence hingga satu karakter (A-Z) sebaiknya tidak dilakukan karena akan membuat program ClustalX salah mengenali karakter nama menjadi salah satu komponen sequence nukleotida atau asam amino. Jadi, contoh seperti: >A caaaatggagagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaac... tidak boleh dilakukan karena nama “A” akan disalahartikan sebagai nukleotida oleh ClustalX. Dataset yang telah siap selanjutnya disimpan dan selanjutnya dimasukan ke dalam ClustalX. Pertama buka program ClustalX, File → Load Sequences. Pilih file dataset yang telah disimpan dan program tersebut akan secara otomatis menampilkan nama sequence pada kolom sebelah kiri dan sequence-nya di kolom sebelah kanan (Gambar 3.1).
Gambar 3.1. Hasil input dataset pada ClustalX.
16
Sebelum melakukan alignment, kita harus terlebih dahulu mengatur file output yang akan dihasilkan. Program ClustalX dapat menghasilkan beberapa macam format file dari satu jenis dataset, yakni: CLUSTAL, GCG/MSF, GDE, NBRF/PIR, NEXUS dan PHYLIP. Masing-masing file output ini mempunyai kegunaan masing-masing karena diperlukan oleh program-program analisis lainnya. Dalam praktikum ini kita hanya akan menggunakan format CLUSTAL (.aln), GDE (.gde), dan PHYLIP (.phy). Pada program ClustalX, pilih Alignment → Output Format Options → klik GDE FORMAT, dan PHYLIP FORMAT → CLOSE. Setelah itu pilih Alignment → Do Complete Alignment. 3.1.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik dengan PHYLIP v3.6.9 (Felsenstein, 2005) Rekonstruksi dengan program ini membutuhkan file input dalam format .phy yang dapat dihasilkan oleh program ClustalX atau MEGA. Program Phylip memiliki serangkaian aplikasi executeable yang dapat menganalisis data sequence dengan berbagai algoritme. Aplikasi yang terdapat pada Phylip antara lain: clique concense contml contrast dnacomp dnadist dnainvar dnaml
dnamlk dnamove dnapars dnapenny dollop dolmove dolpenny draw
drawgram drawtree factor fitch gendist main mix move
neighbor pars penny proml promlk protdist protpars restdist
restml retree seqboot treedist
Rekonstruksi pohon filogenetik pada Phylip dapat dilakukan dengan aplikasi neighbor, fitch, dnapars, dan dnaml untuk sequence nukleotida. Aplikasi neighbor juga dapat digunakan untuk merekonstruksi pohon dengan sequence asam amino, namun sebelumnya harus menggunakan input data yang dihasilkan dari aplikasi protdist. Aplikasi protml dan protpars memiliki prinsip analisis yang sama dengan dnaml dan dnapars, namun menggunakan sequence asam amino sebagai data inputnya. Copy file format .phy ke dalam folder exe yang terdapat di dalam folder Phylip dan kemudian ganti nama file tersebut menjadi infile tanpa menggunakan extension/format apapun. Folder exe terkadang sudah mengandung file dengan nama infile yang disebabkan oleh analisis data yang pernah dilakukan sebelumnya. Apabila kita menjumpai file infile tersebut, hapus terlebih dahulu dan kemudian baru mengganti nama file .phy menjadi infile. Selanjutnya, buka salah satu dari aplikasi yang tersedia dalam folder exe untuk menganalisis infile, dalam hal ini kita akan menggunakan aplikasi neighbor, yakni rekonstruksi dengan algoritme NeighborJoining.
17
Perlu diketahui bahwa rekonstruksi pohon filogenetik yang menggunakan data distance matrix berbasis clustering seperti UPGMA, Neighbor-Joining, dan algoritme Fitch-Margoliash menggunakan data berupa matriks p-distance yang dihasilkan oleh aplikasi dnadist untuk sequence DNA atau protdist untuk sequence asam amino. Dengan demikian, infile perlu dianalisis terlebih dahulu dengan dnadist, kemudian outfile hasil analisis dnadist diubah lagi (rename) menjadi infile untuk dapat dianalisis dengan neighbor. Setelah namanya diubah, buka aplikasi neighbor dan akan tampil menu berupa: Neighbor-Joining/UPGMA method version 3.69 Settings for this run: N Neighbor-joining or UPGMA tree? Neighbor-joining O Outgroup root? No, use as outgroup species 1 L Lower-triangular data matrix? No R Upper-triangular data matrix? No S Subreplicates? No J Randomize input order of species? No. Use input order M Analyze multiple data sets? No 0 Terminal type (IBM PC, ANSI, none)? ANSI 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 4 Write out trees onto tree file? Yes Y to accept these or type the letter for one to change Tekan huruf yang bersangkutan untuk mengubah pengaturan yang diinginkan. Setelah selesai, tekan Y dan Enter. File hasil analisis akan dimuat ke dalam outfile dan gambar pohon dimuat pada outtree. File outfile dapat dibuka dengan Notepad dan dapat di-copy ke dalam MS Excel untuk memudahkan pembacaan, sedangkan file outtree dapat dibuka dengan program Treeview (Page, 1996). Rekonstruksi pohon filogenetik dengan algoritme berbasis character-based seperti maximum parsimony dan maximum likelihood menggunakan file .phy sebagai infile dan tidak perlu dibuat matriks p-distance. Dengan demikian kita dapat langsung menjalankan program dnapars untuk analisis parsimony atau dnaml untuk analisis likelihood langsung terhadap infile. 3.1.3 Pembuatan Matriks Similaritas DNA dengan Phydit (Chun, 1995) Program Phydit menggunakan data input berupa hasil alignment dengan format .gde yang dapat dihasilkan dengan program ClustalX. Salah satu analisis yang dilakukan oleh Phydit adalah penghasilan matriks similaritas nukleotida yang berisi persentase
18
similaritas nukleotida antar pasangan sequence yang dibandingkan tanpa menggunakan model evolusi apapun. Analisis dengan Phydit dilakukan dengan membuat file baru dengan membuka menu File → New atau dengan menekan ikon New Phydit File yang terdapat pada panel atas bagian paling kiri. Sebuah menu akan muncul dimana kita dapat memasukan keterangan file. Isi keterangan apabila diperlukan dan apabila sudah, tekan OK. Phydit kemudian akan menampilkan layar baru bertuliskan No entry to tag. Pada tahap ini, masukan data melalui Data → Import → GDE (NT Replace) untuk sequence nukleotida. Pilih data dalam format .gde dan Phydit akan langsung memasukan sequence berdasarkan entry nama sequence. Penghasilan matriks similaritas nukleotida dapat dilakukan melalui Analysis → SimTable: Generating Similarity Table yang terdapat pada panel atas. Matriks similaritas nukleotida terdiri atas dua bagian, yakni bagian segitiga kanan atas (upper-right triangle) dan segitiga kiri bawah (lower-left triangle). Phydit akan menanyakan jenis data yang akan dimuat dalam masing-masing segitiga tersebut. Pada umumnya kita akan memasukan data similaritas nukleotida (NT Similarity) pada lower-left triangle dan jumlah nukleotida yang berbeda per total nukleotida yang dibandingkan (NT different/Total Nucleotides) pada upper-right triangle. Tekan OK dan akan muncul menu Options; tekan OK lagi untuk melanjutkan analisis. Hasil yang keluar berupa matriks yang dituliskan pada Notepad. Untuk memudahkan pembacaan, copy seluruh tulisan pada Notepad tersebut (ctrl+A kemudian ctrl+C) ke MS Excel dan kemudian simpan. Sebagai tambahan, Phydit juga menyediakan pilihan analisis lainnya yang mencakup: Alignment Reports, menu ini berfungsi untuk menampilkan hasil alignment sequence nukleotida/asam amino dalam bentuk text yang secara otomatis dibuka oleh Notepad. Sequence Statistics, menu ini berfungsi untuk menampilkan frekuensi nukleotida dan frekuensi asam amino dari sequence yang ada. Apabila kita menggunakan sequence nukleotida, adanya statistik frekuensi asam amino pada hasil diasumsikan bahwa sequnce yang dimiliki merupakan coding sequence. 3.2.Konstruksi pohon filogeni menggunakan aplikasi MEGA 4.0 Molecular Evolutionary Genetic Analysis 4.0 (MEGA 4.0) merupakan alat terintegerasi untuk mengolah pemerataan sekuen, menkonstruksi pohon filogenetik, memperkirakan perbedaan waktu, memperkirakan kecepatan evolusi molekuler, menkonstruksi sekuen nenek moyang, dan menguji hipotesis evolusioner. Aplikasi MEGA 4.0 digunakan oleh para ahli biologi di dalam laboratorium untuk merekonstruksi sejarah evolusioner dari suatu spesies dan sifat selektif yang dihasilkan dari kekuatan alam membentuk evolusi gen dan spesies. Langkah-langkah merekonstruksi pohon filogenetik dengan aplikasi MEGA 4.0 lebih singkat daripada dengan cara diatas.
19
Secara garis besar tahapan rekonstruksi pohon filogenetik dengan menggunakan aplikasi MEGA 4.0 terdiri atas: 1. Mengunduh sekuens nukleotida yang kita kehendaki dari GenBank 2. Sequence alignment dengan ClustalW 3. Rekonstruksi pohon filogenetik 3.2.1. Mengunduh sekuens nukleotida dari GenBank Pengunduhan dapat dilakukan dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) dengan format FASTA. Diupayakan sekuens nukelotida yang kita gunakan berasal dari jenis yang sama dan banyaknya sekuen nukleotida tidak jauh berbeda. Apabila kita memilih sekuen dengan panjang yang perbedaan terlalu jauh maka akan mengganggu proses alignment dengan ClustalW. Setelah mengunduh format FASTA dari GenBank kemudian disalin pada program Notepad. Contoh format FASTA sekuen nukleotida dari B. mycoides GMA030 adalah sebagai berikut: >gi|398650471|dbj|AB738786.1| Bacillus mycoides gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: GMA030 GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACCGATTAAGAGCTTGCTCTTAAGAAGT TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGG CTAATACCGGATAACATTTTGCACCGCATGGTGCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATAGAT GGACCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC CGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGT TGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGC GCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACA CCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGCAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCT GAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT CCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAA GTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC CCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGTCGCAAGACCGCGAGGTGGAGCT AATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAA
1. Sequence alignment dengan ClustalW - Buka aplikasi MEGA 4.0, pilih menu Alignment kemudian beri tanda pada pilihan Create new alignment dan klik OK.
20
Gambar 3.2. Membuka menu Alignment pada MEGA 4.0.
-
Data sekuens dalam format FASTA dari Notepad kita salin pada blank sequence dengan cara Ctrl+N untuk menambak kotak blank sequence. Nama Sequence 1, Sequence 2, dst. dapat diganti dengan nama strain asli. Pada kotak sebelah nama strain ditempelkan data sekuen nukleotida. Basa T dengan kotak warna merah, basa G dengan kotak warna ungu, basa A dengan kotak warna hijau, dan basa C dengan kotak biru.
Gambar 3.3. Proses memasukkan nucleotide sequence pada kolom blank sequence.
21
-
Setelah selesai melakukan penambahan sekuens kemudian klik icon W yang merupakan ClustalW. Hasil alignment dengan ClustalW disimpan dengan format file .mega.
Gambar 3.4. Hasil Alignment dengan menggunakan ClustalW. 3.2.2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik - Buka kembali aplikasi MEGA 4, pilih File, kemudian pilih Reopen data, pilih data hasil alignment yang telah dibuat. Pilih menu Phylogeny, kemudian pilih Boostrap Test of Phylogeny, pilih Neighbor Joining (perlu diperhatikan jumlah boostrap sebaiknya 1000 replikasi), dan klik Compute.
Gambar 3.5. Pilihan menu rekonstruksi pohon filogenetik.
22
Pohon filogenetik selesai dibuat. 72 Bacillus anthracis DN 2210 (DNA sample) 38 99 100
Bacillus cereus strain ATCC14579 Bacillus thuringiensis strain CMBL-BT4 Bacillus weihenstephanensis isolate CCM1 Bacillus mycoides strain GMA030
31
Bacillus aquimaris isolate L-36 Bacillus pumilus strain X-6-19
62
Bacillus licheniformis strain VPS50.2
99 98
59 100 81
Bacillus subtilis strain ATCC 21331 Bacillus megaterium strain GMA479 Bacillus flexus partial 16S rRNA gene Bacillus cohnii gene for 16S rRNA Bacillus indicus 16S ribosomal RNA gene
88
15
86
Bacillus coagulans strain NRIC 1527 Bacillus methanolicus strain NCIMB 12524 Bacillus circulans strain Q11
17 41 51
Bacillus firmus strain D1 Bacillus lentus strain IAM 12466 Bacillus fusiformis gene for 16S rRNA Oceanobacillus caeni gene for 16S rRNA Bacillus larvae 16S rRNA
0.005
Gambar 3.6. Rekonstruksi pohon filogenetik dari 21 spesies Bacillus sp.
23
DAFTAR PUSTAKA Brenner, D. J., N. R. Krieg, J. T. Staley & G. M. Garrity. 2005. Bergey's manual of systematic bacteriology 2nd edition, volume 2: The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria. Springer Pub.: USA. Chun, J. 1995. Computer-assisted clasification and identification of actinomycetes. Ph.D. Thesis. University of Newcastle, UK. Felsenstein, J. 2005. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, USA. Goodfellow, M. 1997. Microbial Systematics. In Microbiology and Medical Microbiology. University of Newcastle Upon Tyne. Kovach, W.L., 2007. MVSP - A MultiVariate Statistical Package for Windows, ver. 3.1. Kovach Computing Services, Pentraeth, Wales, U.K. Larkin, M. A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T. J. Gibson, & D. G. Higgins.2007. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 2947–2948. Page, R. D. M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12: 357–358. Priest, F. & B. Austin. 1993. Modern Bacterial Taxonomy 2nd Edition. Chapman & Hall Pub.: England. Sembiring, L. 2002. Sistematika Mikrobia (BIO 668) Petunjuk Praktikum. Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia. Sembiring, L. 2002. Sistematika Molekular (BIO 765) Petunjuk Praktikum. Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia. West, P. A., P. R. Brayton, T. N. Bryant, & R. R. Colwell. 1986. Numerical taxonomy of vibrios isolated from aquatic environments. International Journal of Systematic Bacteriology 36 (4): 531–543.
24
