TEKNIK PENGAMBILA]\I JARINGAI\T DAI\T TEKNII( }TENA}TAM-} oleh: Dra. Kamsinah, Ivgt
**)
1. Pendahuluan Kultur jaringan merupakan metoda untuk mengisolasi/memisahkan bagian tanaman; seperti sel, jaringan atau organ dan menumbuhkannya secara aseptis (suci hama) di tanaman lengkap.
Prinsip kultur jaringan terdapat pada teori sel yang dikemukakan oleh Ahli Biologi Jerman M.J. Schleiden danT. Sclrwann.
Secara
Implisit teori tersebut menyatakan bahwa sel tumbuhan bersifat autonom dan
mempunyai totipotensi.
Autonom
*
dapat mengatur rumah tangga sendiri
turnbuh dan berkembang secara independent-
-
melakukan metabolisme ---
Totipotensi ---+ kemampuan sel tumbuhan (somatic/vegetatif atau sel gamet) -+ tumbuh menjadi tanaman lengkap. organ tanaman yang tumbuh dan berkembang serta beregenerasi secara aseptis pada medium di dalam wadah gelasltabung yang transparan.
Kultur in vitro tanaman ialah sel, sekelompok sel atau
Bagian kecil dari tanaman (sel, jaringan atau organ) yang digunakan untuk kultur disebut eksplan.
Eksplan harus yang muda --- sel masih meristematis dan sudah mengalami proses diferensiasi.
Meristem ialah sekumpulan sel yang mempunyai sifat selalu membelah. Sel-selnya kecil, inti sel relative besar, penuh plasma, vakuola kecil dan banyak (tampak mirip busa). Dinding sel tipis (dinding primitif), terdiri atas zat pectin/protopektin, penebalan dinding primer dari selulos a yang masih tipis.
bio.unsoed.ac.id .l
Disampaikan dalam rangka Unsosd Fair di Graha Widya Tama pada taaggal 17'24 November 2016. **) Page L Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Fellogen
o Tanaman
r
Induk (diisolasi)
o
Mengubah pola metabolisme Sel memulai siklus baru Tumbuh dan berkembang dalam kultur
bio.unsoed.ac.id Kondisi StresS
.l
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tamapadatanggal 17-2A November 2016. **) Page2 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
2. Peneambilan Eksplan 2.1. Memilih EksPlan
Dalam waktu lamatidak membentuk kalus
Terjadi penambahan volume tanpa penambahan jumlah sel
bio.unsoed.ac.id .)
Disampaikan dalam rangka Unso€d Fair di Graha Widya Tama pada tanggal 17'24 November 2016. **) Page 3 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Pertambahan volume
Diferensiasi sel
Pembelahan sel
Pertumbuhan Sel Pada Jaringan Meristem
2.2. Asal Eksplan a. Dari Tanaman Dewasa Diambil dari pucuk tanamau dengan keuntungan cepat tumbuh, namun sterilisasi harus cermat. Pada medium kultur jaringan dapat terkenaphenolic compound,yaif.t muncul warna coklat pada permukaan eksplan. Peristiwa ini disebut browning.
Hal ini disebabkan oleh phenol yang dikeluarkan tanaman dewasa. Phenol akan mengikat oksigen dari udara membentuk senyqwa phenolik, sehingga eksplan berwarna coklat kemudian mati.
b.
Dari Tanaman Hasil Cangkokan Berasal dari tanaman yang telah dicangkok tiga kali.
bio.unsoed.ac.id .l
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha lVidya Tama padatanggal 17-20 November 2016. **) Page 4 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Tanaman dengan sifat-sifat
baik
Pencangkokan
I Pencangkokan
II
Dewasa
@alam rumah kaca)
Dari Tanaman Hasil Seedling Biasanya dilakukan untuk eksplan dari tanaman keras. Berasal dari biji yang cukup tua; dapat langsung dipetik dari pohonnya, dad balai benih atau dari pasar.
bio.unsoed.ac.id .l
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggal 17-24 November 2016. **) Page 5 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
dikeringkan
ffi \-----l
i
./-E.*---il;\> \____-,'
Kultur steril
bio.unsoed.ac.id ;ffi **)
ur*-d
Fair di Graha widya Tama pada tanggal 77-20
November 2016. Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Page 6
3.
Materi EksPlan
Vegetatif (meristematik)
bio.unsoed.ac.id qDtrr*p"1.*,j.h* *"gkr-Ur*d **)
i;r
November 2016. Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
di Gratra \Yidya Tama pada tanggal
fi.24 PageT
4.
Prosedu r Pengambilan EksPlan
4.1. Eksplan Meristem APikal Tebu daun' - Ambil meristem apical tJbu 20 - 30 cm, helaian daun dipotong dekat sarung - Material dimasukkan ke dalam spiritus lalu dibakar. Kemudian 1 - 2 helai
-
seludang daun dibuang. Bagian ujung materia-l tebu di bakar tagi, Perlakuan ini diulang sampai beberapa kali'
diikuti penglepasan seludang terluar'
siap untuk Setelah batang Ueirta seludangnya yang putih terlihat, bahan dijadikan eksPlan. ditanam pada Eksplan dipotong-potong melintang setebal 2 - 4 mm, kemudian media kultur.
3
Pucuk tanaman dengan titik tumbuh Pctongan pucuk anaman yang ahan dianrbiliaringannya' Potongan prcuk tanaman setelah dikelupas pelepah daunnya
4
Pemotongan
5
A
Balrall jaringan yang siap untuk Juingan rneristem daun
B
Jaringan garenkhim batang
I
2
juingan
dikulnr*a*
* A
J
*e*a-=;'8-E
il
-ErEl
bio.unsoed.ac.id
Sumber: Hendaryono dan Wijayani, 1994.
TDi**prik*ad"* r*gd *o**O
Fair di Graha lyrdya Tama pada tanggal
November 2016. '*) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
17
-24 Page 8
4.2. Eksplan Meristem Akar Wortel jika Bahan yang digunakan ialah umbi akamya, tetapi lebih baik lagi menggunakan'J aringan kambium" dan sekitarnya' Langkah kerja:
-
-
Umbi wortel dicuci dengan deterjen, kemudian disterilisasi fisik dengan
pembakaran. Sterilisasi dengan 0,17o sublinrat, (pencucian)' Kulit luar dikupas dalam laminair air flow (secara steril).
Material dipotong setebal 2 cm, dimasukkan ke dalam sublimat + 3 menit,kemudian dicuci dengan air steril 3 - 4 kali' Dipotong-potong 2 mm x 2 mm x 2 mm untuk ditanam pada media kultur.
bio.unsoed.ac.id
Sumbsr : Hendaryono dan'Wijayani, 1994.
;iOiru*fuik*
dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tamapadatanggal 17-24 November 2016. **) Page 9 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
4.3. Eksplan Daun Tembakau Seedling Seedling berasal dari biji tembakau yang telah diseleksi. Biji yang tenggelam dalam air dipilih dan ditanam. Brji yang telah tumbuh diambil daunnya untuk bahan eksplan.
Langkah kerja: - Diarnbil daun tembakau yang rnasih muda, dicuci dengan deterjen hingga bersih. - Disterilkan dengan l0% Chlorox + I tetes tween 20 selama 5 menit. Sterilisasi dengan sublimat. - Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali. Sterilisasi dilakukan dalam kondisi
-
aseptis.
Daun dipotong dengan ukuran 3 mm media kultur.
x 3 mm kemudian ditanam
pada
Untuk eksplan yang berasal dari daun yang diambil langsung dari lapang (alam), sterilisasi sebaiknya dilakukan dua kali. - Dengan Chlorox l0Yo + 1 tetes tween 20 selama l0 menit. - Dengan Chlorox TAYo + I tetes twee 20 selama 5 menit. - Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali.
Keterangan:
A
:
Ibu tulang daun, paling banyak mengandung berkas pen$ngkut bik untuk eksplan.
B
:
Bagran
urd daun hanya berupa sel mesofil yang bertotipoteasi lsbih kecil, tidak baik untuk eksplan.
bio.unsoed.ac.id .)
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggal l7-ZA November 2016. **) Page 10 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Keterangan: Yang paling baik digunakan sebagai eksplan adalah bagran tengah dari tangkai dauru sehingga tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda. Dibuat luka@a permukaannya.
Sumber : Hendaryono dan Wijayani,7994.
4.4. Eksptan Mata Tunas Anggrek Mata tunas dari :
a. tangkai Bunga PhalaenoPsis, b. keiki atau tunas yang muncul dari batang anggrek yang sudah tua,
c.
batang anggrek CattleYa.
Langkah kerja: Tangkai bunga anggrek. Tangkai bunga dipotong 3 cm dari mata tunas ke atas dan ke bawah. Disterilkan dalam chlorox 10% + 1 tetes tween 20 selama 10 menit. Seludang yang menutupi mata tunas dibuang. Disterilkan dalam Chlorox 5yo + I tetes tween 20 selama 5 menit. Dicuci dengan air steril 3 - 5 kali. Tangkai bagian atas dan bawah dipotong sedikit, kemudian ditanam dalam mediakultur.
bio.unsoed.ac.id .)
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggal November 2016. *') Dos"n tetap Fakultas Biologi Unsoed
fitA Page 11
ffi fritil
E# A
c
Gambar 35. Eksplan dari tangkai bunga anggrek.
Kelercngan:
A B C D
Cara rremotong tangkai bunga, yaitu 3 cm di atas dan 3 cm di bawah mate tflnas Mata tunas dihilangkan dari sisik-sisik yang menutupi Tunas telanjang yang telah siap untuk ditanam Cara nmnanam eksplan dalam medium Yacin & Wnet
5. Teknik Penanaman 5.1. Menabur Eksplan Menabur eksplan dilakukan di dalam laminair air flow dengan kondisi aseptis. Sebelum bekerja di dalam laminair air flow, semua perhiasan tangan, misalnya cincin, gelang, arloji dan sebagainya harus dilepas. Tangan dibasuh dengan alcohol 70olo. Selama menabur eksplan harus mengenakan masker penutup mulut dan hidung. Eksplan yang telah siap ditanam yaitu yang sudah steril, dipotong-potong di dalam cawan Petri steril dengan menggunakan skalpel. Potongan eksplan dapat berbentuk segi empat, silinder, segitiga, limas dan sebagainya. Bentuk potongan eksplan tergantung pada macam eksplan yarlg akan ditanam. Potongan eksplan berbentuk silinder seperti pada eksplan pucuk batang tebu merupakan potongan yang lebih baik karena mempunyai permukaan lebih luas
bio.unsoed.ac.id
.)
Disampaikan dalam rangka Unsod Fair di Graha Widya Tama padatanggal November 2016. **) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
fiA\ Page72
dan volume lebih
tinggi. Bentuk potongan
eksplan seperti
ini akan
memudahkan pertukman gas dan makanan, sehingga eksplan dapat tumbuh dengan baik. Potongan eksplan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media kultur, sampai pennukzuln yang dipotong bersentuhan dengan media. Kemudian Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi di dalam ruang incubator dengan suhu dan intensitas cahaya sesuai dengan yang diinginkan.
5.2. Melaksanakan Sub-kultur Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah $ratu massa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau pada irisan eksplan. Kalus akan tumbuh pada eksplan yang ditanam pada media padat.
Sub-kultur adalah usaha untuk mengganti media tanam kultur jaringan dengan media baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus akan terpenuhi. Pada kultur dengan menggunakan media padat, kalus yang terbentuk diambil dan diletakkan pada cawan Petri, kernudian dipotong-potong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil dengan menggunakan skalpel dan pinset. Potongan-potongan kecil tersebut segera dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media baru dengan komposisi sama seperti media lama. Erlenmeyer ditutup kembali dengan aluminium foil dan diinkubasikan. Pelaksanaan subkultur dilakukan di dalam suasana steril.
53. Menumbuhkan Planlet Setelah kalus berhasil ditumbuhkan, dilanjutkan dengan menumbuhkan planlet. Media yang digunakan untuk menumbuhkan planlet berbeda dari media untuk menginduksi pertumbuhan kalus. Untuk menumbuhkan planlet digunakan media diferensia yang komponen-komponen kimiawinya berbeda dari media induksi kalus. Faktor-faktor lingkungan seperti intensitas cahay4 suhu dan kelernbaban juga berpengaruh terhadap diferensiasi planlet.
Untuk mendiferensiasi kalus agar tumbuh akar dan tunasnya, dapat digunakan media apa saja yang sesuai dengan media induksi yang digunakan sebelumnya. Bila menggunakan Media MS, maka akan lebih baik bila konsentrasi media diferensiasi sebesar setengah dari konsentrasi media induksi kalus. Selain itu, zat pengatur tumbuh 2,4-D atau NAA tidak digUnakan lagi. Bila masih mengandung zat pengatur tumbuh tersebut, maka akan tumbuh kalus saja tanpa terbentuk tunas.
bio.unsoed.ac.id
.l
Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tamapadatanggal 17-24 November 2016. **) Page 13 Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
Zat pengatur tumbuh yang dianjurkan untuk menumbuhkan planlet ialah sitokinin dan auksin dengan perbandingan tertentu. Dapat digunakan Metoda Mohr dengan dosis 2 dan 3 ppm untuk auksin dan sitokinin atau sebaliknya. Sitokinin yang biasa digunakan ialah kinetin, sedangkan auksinnya ialah IAA. Berdasarkan pengalaman, bila auksin ditambahkan dengan dosis lebih besar maka akan keluar banyak akar; bila sitokinin yang lebih besar dosisnya maka akan tumbuh banyak tunas.
Daftar Pustaka Hendaryono, D.P.S. dan A. Wijayani, 1994. Teknik Kultur Jaringan, Pengenalan dan petunjukperbanyakan tanaman secara vegetatif-modern. Kanisius, Yogyakarta.
bio.unsoed.ac.id .]
ffiwffi..-^
Disampaikan dalam rangka unsoed Fair di Graha widya Tama pada tanggal November 2016. **) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed
fia\ Page 14
