Jablonski diagram
Bevezetés a fluoreszcenciába
internal Belső konverzió conversion
Gerjesztett Excited Singlet Manifold szingulett állapot
S2
•
Excited Triplet Triplett állapot
•
•
Manifold
kisc
S1
k -isc
k nr k f
T1
k' nr
fluorescence fluoreszcencia
kp phosphorescence
foszforeszcencia
Intersystem crossing Triplett állapot
Singlet Ground State szingulett alapállapot
S0
Belső konverzió Kasha szabály
Triplett állapot foszforeszcencia; szignifikánsan hosszabb élettartam Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Relaxációs lehetőségek
• Mi a fluoreszcencia?
Magasabb E és vibrációs állapot Legalacsonyabb E szingulett
– a fluorofór molekula gerjesztett állapotból történő visszatérése – foton Abszorpció(1) eredményeként jön létre a folyamat – gerjesztett szingulett állapothoz vezet, S1
Triplett állapotba történő
– S1 állapotból szubnanoszekundumos relaxáció (2) következik
Abszorpció
ΔE
„Tiltott átmenet”
– melyet spektrálisan a vörös hullámhossztartomány (3) felé eltolt fényemisszió követ (Stokes féle eltolódás) • a Stokes féle eltolódás teszi a fluoreszcenciát érzékeny spektroszkópiás technikává
alapállapot fluoreszcencia
foszforeszcencia
késleltetett fluoreszcencia
Az első szingulett gerjesztett állapotból való visszatérésre többféle alternatíva kínálkozik a molekula számára Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
A különböző relaxációs folyamatok élettartamai
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
1. gerj. állapot
szingulett állapot
Intenzitás
alapállapot
triplett állapotok
Hullámhossz Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Abszorpciós spektroszkópia
Fluoreszcencia paraméterek Ahhoz, hogy karakterizáljuk egy ismeretlen molekula rendszer fotoindukált emisszióját, meg kell határoznunk a hullámhossz függvényében • • • •
abszorbeáló c koncentrációjú közeg
az abszorpció és emisszió spektrális eloszlásait, a kvantumhatásfokot a gerjesztett állapot élettartamát az emittált fluoreszcencia polarizáltsági fokát
I = I 0 10 −ε ( λ ) cl Lambert-Beer
úthossz l
Gregorio Weber, Meth. Enzym. 278, p. 1 (1997)
• spektrális eloszlás – Kibocsájtási (emissziós) spektrum: Rögzített gerjesztési hullámhossz mellett mérjük a fluoreszcencia intenzitás hullámhossz függését – Gerjesztési (excitációs) spektrum: Rögzített emissziós hullámhossz mellett mérjük a gerjesztési spektrumot (hullámhossz függvényében) : általában ua. mint az abszorpciós spektrum
T=
I I0
A = − log T = − log Abszorbancia
Transzmittancia
A = − log T = ε ( λ ) cl
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Spektrális eloszlások meghatározása
Spektrális eloszlás
ECFP chromophore
1.00
fényforrás Monokromátor
Detektor
434 nm exc.
Fluoreszcencia gerjesztés
500 nm det.
0.80
Minta
Fluoreszcencia emisszió
Normalizált fluoreszcencia intenzitás Normalized Fluo. Intensity ill. Abszorbancia
Spektrofotométer
0.60
Tryptophan 0.40
0.20
0.00 250
300
350
400
450
500
550
600 300
Wavelength [nm] Hullámhossz [nm]
350
400
450
500
550
600
Hullámhossz, nm
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
I I0
Fluoreszcencia élettartamok
Spektrális eloszlások meghatározása Minta
az összes kompetáló folyamat befolyásolja a mérhető élettartamot.
Spektrofluoriméter
dN = − N ( k f + k ic + k isc ) dt
fényforrás Monokromátor gerjesztő impulzus fluoreszcencia intenzitás
Fluoreszcencia gerjesztés
Fluoreszcencia emisszió
Detektor
−(k f +kic +kisc)t
N = N0e
τ int = 1 k f + k ic + k isc Q = k fτ
300
350
400
450
500
550
600
Hullámhossz, nm Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Fontos Fluoreszcencia paraméterek • Kvantumhatásfok
• Fluoreszcencia élettartam (τ) karakterisztikus idő melyet a fluorofór a gerjesztett állapotban tölt.
– a festék emissziós képességének jellemzője
Q=
Fluoreszcencia élettartamok
kf fluor. átm. v. sz. Q = # emittált foton Q= k f + kic + kisc # abszorbeált foton összes átm. v. sz.
• Intenzitás – egyenesen arányos az anyag abszorpciós képességével (extinkciós együttható, ε) – Kvantumhatásfok, Q
F = I 0ε [c]lQ
τ int = 1/(k f + kic + kisc )
• A gerjesztett állapotban töltött idő alatt a molekula a környezetével számos kölcsönhatáson megy át. – – – –
teljes fluoreszcencia •
ahol I0 a belépő gerjesztő fény intenzitása, – l a gerjesztési úthossz
•
– [c] festék (fluorofór) koncentráció Jenei A. (2007-08)
kollíziós kioltás fluoreszcencia energia transzfer intersystem crossing rotációs mozgás
Homogén rendszer esetén (fluorofór + oldat) az élettartam egy komponensből áll Heterogén rendszerek esetén többkomponens mérhető
Jenei A. (2007-08)
Fluorofórok-2 •
Közönséges fluorofórok – exogén festékek Fluorescein, Rhodamine, Acridine Orange, Ethidium Bromide, Cy – endogén fluorofórok - NADH autofluoreszcencia, stb.
FLUORESCEIN Molekuláris képlet: C20H12O5 Molekula tömeg: 332.31 Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Flurofórok-3
Fluorofórok
• Fehérjék
• Mi az a fluorofór?
– Phycobiliproteins - phycoerythrin, allophycocyanin – Green Fluorescent Protein - GFP
– olyan molekula amelyik „fluoreszkál” – néhány aminosav, különösen Trp, Tyr és Phe
• Új festékek – nanokristályok (core/shell quantum dots) Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Gyakran használt fluorofórok
Fluoreszcencia mérése
• Spektrofluoriméter – excitációs és emissziós spektrum – monokromátor – oldatok vizsgálata (küvettában)
• Fluoreszcens mikroszkóp – fluoreszcencia eloszlás – biológiai rendszerek (sejtek stb.) vizsgálata. – optikai szűrők használata
Jenei A. (2007-08)
Fluorofórok néhány alkalmazása
Jenei A. (2007-08)
Fluoreszcencia mérése
• Immunofluoreszcencia • ion szenzitív festékek -K+, Na+, Ca2+ specifikus markerek -pH indikátorok
• membránpotenciál – megnövekedett intracelluláris fluoreszcencia
• DNS festékek • fehérje fluoreszcencia meghatározási módszerek
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Optikai szűrők
Fluoreszcencia mérése
Jenei A. (2007-08)
Optikai szűrők
Jenei A. (2007-08)
Optikai szűrők - 2
kibocsátott fény Tipikus filter elrendezés mikroszkópban gerjesztő fény
minta Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Fényforrások
Fluoreszcens képalkotás
• FITC-el (fluorescein isothiocyanate) és Rhodamine-phalloidin-nal jelölt sejt a microtubulusok és az aktin filamentumok látahtóvá tételére. Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
Optikai szűrők kiválasztása Wild Type GFP
Fluorescence Excitation
Fluorescence Emission
300
350
400
450
500
550
600
Wavelength, nm
Chroma Technology 32000 WTGFP Bandpass Filter Set
Tumor sejtek aneuploidiájának kimutatása FISH-el
FRET Fotofizikai következményei D*
A* •
FRET esetén a donormolekula számára létezik egy alternatív relaxációs lehetőség
• Energia Transzfer esetén – Donor gerjesztett állapotának (D*) élettartama csökken – Donor fluor. intenzitása csökken – Donor photobleaching (fotohalványítás) sebességi állandója csökken – Akceptor fluoreszcencia intenzitása ( ha a donor jelen van) növekszik Jenei A. (2007-08)
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET) A
D*
Jenei A. (2007-08)
FRET detektálása A*
• Spektrális változások – akceptor fluoreszcencia intenzitása növekszik – donor fluoreszcencia csökken
D* Donor és akceptor távol egymástól - No FRET
• Fluoreszcencia élettartam Donor és akceptor közel egymáshoz - FRET
• fénykibocsátás nélküli (elektromágneses dipólus-dipólus) átmenet a gerjesztett kromofór (donor) felöl a receptor molekula (akceptor) fele. • dinamikus „Förster” transzfer folyamat • meglehetősen távolságfüggő ∝ 1/R6 • hatékony eszköz molekula asszociációk, fehérje-fehérje, receptor-ligand kölcsönhatások vizsgálatára • FRET távolság tartománya: 2-10 nm Jenei A. (2007-08)
– Csökkenő donor oldali élettartam
•Donor Photobleaching (fotohalványítás) – a donor molekulák un. photobleaching sebességi állandója akceptor jelenlétében csökken
•Akceptor Photobleaching – erős, akceptort gerjesztő fényt alkalmazva akceptor mentes terület –megnövekedett donor fluoreszcencia
Jenei A. (2007-08)
Alkalmas FRET festékpárok kiválasztása
Fluorofórok fotoszelekciója polarizált gerjesztő fény segítségével
ECFP/EYFP
Normalized Fluo. Intensity
1.2 ECFP, ex ECFP, em EYFP, ex. EYFP, em
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 350
400
450
500
550
600
vertikálisan polarizált gerjesztő fény
650
Wavelength, nm
kiválasztott populáció Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
A Förster típusú energiatranszfer hatásfok távolságfüggése
Minta
Monokromátor Polarizátor
p=
R06 E= 6 R0 + R 6
IVV −G I VH IVV +G I VH
r=
IVV −G IVH IVV +2G IVH Detektor
G=
Jenei A. (2007-08)
Jenei A. (2007-08)
I HV I HH
1 1 ⎛ kT ⎞ = ⎜1 + τ ⎟ r r0 ⎝ Vη ⎠
fotonszám
Jenei A. (2007-08)
idő
Jenei A. (2007-08)
