BENZO[a]PYREN, JEHO ZDRAVOTNÍ DOPADY A ZNEČIŠTĚNÍ NA OSTRAVSKU
R. J. Sram Ústav experimentální mediciny AV ČR, Praha (
[email protected])
ARNIKA, Praha, 27. 11. 2013
AIR PARTICLES (< 10 µm) (Filtres from HiVol Samplers - Winter, Summer)
DNA binding activities in vitro acellular assay 32P - postlabeling and HPLC analysis of DNA adducts
Binkova et al. 1999 R. J. Sram 2013
CONTRIBUTION OF THE MAJOR PAH-DNA ADDUCTS TO THE TOTAL DNA ADDUCTS LEVEL FROM URBAN SAMPLES
PAH-DNA adducts derived from
9-OH-B[a]P anti - BPDE B[b]F B[k]F
B[j]F CHRY B[a]A I[c,d]P
Total radioactivity from all DNA adducts detected approx. 50 % R. J. Sram 2013
(Binkova et al. 1999)
B[a]P 2012
AIR POLLUTION 2012 (CHMI) Locality
PM10 µg/m3
PM2.5 µg/m3
B[a]P ng/m3
Ostrava-Poruba
35.1 ± 31.2
27.3 ± 27.6
3.3 ± 5.0
Ostrava-Radvanice
49.5 ± 40.3
39.4 ± 31.2
10.8± 13.7
Karvina
45.8 ± 44.7
X
8.2 ± 11.1
Havirov
44.3 ± 43.7
X
X
Prague-Smichov
30.2 ± 15.6
14.8± 8.8
Prague-Libus
27.8 ± 14.5
17.3 ± 12.6
1.1 ± 1.5
Ceske Budejovice
22.8 ± 16.0
18.6± 13.7
1.7 ± 2.0
x - not measured R. J. Sram 2013
X
VÝZNAM k-PAU VE ZNEČIŠTĚNÉM OVZDUŠÍ
výsledky
plodnost
respirační
kardiovaskulární
těhotenství
mužů
nemocnost dětí,
onemocnění,
(IUGR, LBW,
psychický
cukrovka,
působí jako ED)
vývoj
nádory
RIZIKO PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ R.J.Sram 2013
MECHANISM OF CARCINOGENIC ACTION OF PAHs
Rundle, 2006
HUMAN STUDIES AND BIOMARKERS OF EXPOSURE, EFFECT AND SUSCEPTIBILITY PM2.5 Stationary monitoring
DNA adducts by 32P-postlabeling
c-PAHs Personal monitoring Stationary monitoring
Chromosomal aberrations FISH, micronuclei
VOC
Personal monitoring Stationary monitoring
Cotinine Triglycerids, Total, HDL and LDL cholesterol Vitamins A, C, E R. J. Sram 2013
Oxidative damage 8-oxodG, 15-F2T-isoP, proteins Genetic polymorphisms Gene expression
PERSONAL MONITORING IN PRAGUE
R.J. Sram 2013
(foto Ludvik Hradilek, Aktualne.cz)
AUTORADIOGRAPHS OF THIN LAYER CHROMATOGRAMS WITH DNA ADDUCTS PATTERN OF:
DNA isolated from lymphocytes of subject sampled in January 2004 (1st sampling period)
R. J. Sram 2013
Water blank
Positive control (DNA isolated from the lung of rats intraperitoneally treated with 100 mg B[a]P/kg b.w.)
CYTOGENETIC ANALYSIS FISH analysis
t(Ab);t(Ab);t(Ba)
R. J. Sram 2013
Three translocations between chromosome 1 and unpainted chromosomes
R. J. Sram 2013
MICRONUCLEI
R. J. Sram 2013
R. J. Sram 2013
REACTIVE OXYGEN SPECIES Exogenous sources
Endogenous sources
O2
SOD
H2O2
OH•
Lipid peroxidation R. J. Sram 2013
DNA oxidation
Catalase
H2O + O2
H2O
Protein oxidation
Driven by:
Pathway-2 organic compounds
Pathway-1 surface reactivity
OC-H PM
OC-L PM
Phase I (Cyp1a1 -)
ROS
Surface Reactivity
ROS
Oxidative Effect
Phase II
ROS NFkB
(Gst, Ngo1…-)
API
Proinflammatory response R. J. Sram 2013
Bioactivation Biotransformation
Conjugation
Phase
III
Elimination
SCSA® - Acridine Orange Stained DNA
Native DNA Stainability (green fluorescence)
100
0 R. J. Sram 2013
Fragmented DNA (red fluorescence)
100
?
VÝSLEDKY MOLEKULÁRNĚ EPIDEMIOLOGICKÝCH STUDIÍ
(genomová frekvence translokací-FISH, mikrojadérka, fragmentace DNA ve spermiích)
koncentrace
> 1 ng B[a]P/m3 v ovzduší
RIZIKO PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ (WHO Bonn 6. 11. 2009) R. J. Sram 2013
Znečištěné ovzduší při koncentraci > 1 ng B[a]P/m3
DNA adukty – 32-postlabelling Genomovou frekvenci translokací Frekvenci jadérek Fragmentaci DNA ve spermiích
R. J. Sram 2013
VLIV ZNEČIŠTĚNÉHO OVZDUŠÍ NA VÝSLEDKY V TĚHOTENSTVÍ
R. J. Sram 2013
PREGNANCY OUTCOME -RISK OF c-PAHs
AMBIENT EXPOSURE to 15 ng c-PAHs/m3/month (2.8 ng B[a]P/m3)
INDOOR EXPOSURE (50-60%) approximately to 9 ng c-PAHs/m3/month (1.7 ng B[a]P/m3) R. J. Sram 2013
DŮSLEDKY IUGR Dětská úmrtnost Dětská nemocnost Zpoždění vývoje Cukrovka Hypertenze Ischemická choroba srdeční
R.J.Sram 2013
VLIV B[a]P NA EXPRESI GENŮ V TĚHOTENSTVÍ
R. J. Sram 2013
Vývoj koncentrací polutantů (měsíce) B[a]P
benzen
7
4 3,5
5
benzen (µg/m3)
B[a]P (ng/m3)
6 4 3 2 1 0
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
PM2.5 (µg/m3)
2008
2009
3
5
7
9
11
1
3
2008
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Praha
3
5
7 2008
9
11
1
3
5
7 2009
9
11
5
7 2009
PM2.5
1
R. J. Sram 2013
1
České Budějovice
9
11
Výsledky stanovení DNA aduktů v žilní a pupečníkové krvi a v placentě (Porovnání - Praha a České Budějovice)
Adukty/108 nukl.
N Praha
Žilní krev matky
Pupečníková krev
Průměr ± S.D.
Průměr ± S.D.
Placenta Průměr ± S.D.
B[a]P-like
Celkové
B[a]P-like
Celkové
B[a]P-like
Celkové
80 0.24±0.18
1.23±1.09
0.23±0.18
0.98±0.89
0.24±0.18
1.15±1.06
0.41*±0.41
1.40*±1.31
0.54*±0.48
1.94* #±1.46
Čes. Budějovice 76 0.44*±0.39 1.59*±1.46
*p<0.001 – významně vyšší hladiny celkových i tzv. B[a]P specifických DNA aduktů ve všech tkáních byly nalezeny u matek a dětí z Českých Budějovic #p<0.001 – významně vyšší hladiny hladiny DNA aduktů v placentě než v žilní a pupečníkové krvi u matek a dětí z Českých Budějovic R. J. Sram 2013
MICRONUCLEI IN NEWBORNS
PRAGUE (86) 2.17 MN/1000 BC
TOWN (40) 3.45 MN/1000 BC
R. J. Sram 2013
CESKE BUDEJOVICE (92) 3.82 MN/1000 BC
VILLAGES (52) 4.11 MN/1000 BC
Microarray analýza genové exprese - metodika Odběr vzorků
- stabilizace expresního profilu (RNAlater, PAX system, LeukoLOCK)
Izolace RNA a ověření kvality (Agilent Bioanalyzer)
Gene expression profiling - přepis RNA do cRNA (Ambion) - hybridizace na HumanRef-8 Expression - skenování (Illumina ArrayReader) Statistická analýza dat (Illumina BeadStudio Software, R program)
R. J. Sram 2013
BeadArrays
Změny v transkriptomu těhotných žen v Praze vs. Českých Budějovicích Soubor: 35 nekuřaček z Prahy vs. 52 nekuřaček z Č. Budějovic - periferní krev (PB), placenta (PL), pupečníková krev (UCB) ŽMnožství
polycyklických aromatických uhlovodíků v ovzduší v Praze se začíná významně snižovat
ŽZvýšená
ŽVyšší
hladina DNA aduktů ve všech typech tkání matek z Č. Budějovic v porovnání s Prahou
hladina peroxidovaných lipidů u vzorků z Prahy
Cíl: srovnání expresních profilů vzorků PB, PL a UCB získaných od těhotných žen z obou lokalit vzhledem k odlišnému působení genotoxických látek v těchto lokalitách R. J. Sram 2013
DEREGULATION OF GENES Cord blood Change: 104 genes 37 67
CB
Increased expression in CB: genes related to metabolism of xenobiotics
Decreased expression in CB
genes related to immune response and autoimmune diseases
ZÁVĚRY 1. Detekce zvýšené exprese genů spojených s působením genotoxických látek ve všech
tkáních z ČB je v souladu s vyšší expozicí genotoxickým látkám naměřenou v této lokalitě. vysoká míra tkáňové specifity (zejména u pupečníkové krve) opačný trend deregulace některých buněčných drah mezi vzorky periferní a pupečníkové krve (specifické imunitní procesy a s nimi asociované autoimunitní choroby aktivované u periferní a naopak suprimované u pupečníkové krve z ČB
Periferní krev
27
Placenta 1137
0
384
6
7
Pupečníková krev 91
2. Vysoký počet genů detekovaný u PL a naopak nízký u UCB, malý překryv deregulovaných genů mezi UCB a ostatními tkáněmi a opačná regulace imunitních procesů jsou známky, které poukazují alespoň na částečnou detoxifikační funkci placenty. R. J. Sram 2013
GAMETICKÉ MUTACE
R. J. Sram 2013
POŠKOZENÍ GENOMU
POČÁTEK NEMOCI
NUTNOST PREVENCE ! R. J. Sram 2013
PROGRAM OSTRAVA VÝSLEDKY VÝZKUMU
40
R.J.Sram 2013
ZDRAVOTNÍ STAV U DĚTÍ
R. J. Sram 2013
Z. horních cest dýchacích + průdušek + hrtanu a průdušnice + plic + angína + z. středního ucha
Incidence/dítě
7 6 5
M.O. (413) Hrab. (595) Zábř. (348) Por. (313) R. a B. (154)
4 3 2 1
1st
2nd
3rd 4th roky roky
R.J.Sram 2013
5th
6th
ASTHMA BRONCHIALE U DĚTÍ
R. J. Sram 2013
Comparison of ‘no asthma’ vs. ‘asthma’ t-test results
In the Venn diagrams shown below, the t-test results obtained using all experiments either with a p-value cutoff of 0.01 or a p-value cutoff of 0.01 and at least a 1.5 fold change are compared P-value ≤ 0.01 no asthma vs. asthma control region
no asthma vs. asthma
no asthma vs. asthma
P-value ≤ 0.01 fold change ≥ 1.5
no asthma vs. asthma control region genes specific for asthma in Prachatice
no asthma vs. asthma Ostrava R. J. Sram 2013
genes specific for asthma in Ostrava
no asthma vs. asthma Ostrava
no genes common for both regions
Souhrn Asthma bronchiale na Prachaticku - alergický typ astmatu, odpověď na alergen. Asthma bronchiale v Ostravě - nealergický typ astmatu, vyvolán iritanty - znečištěné ovzduší, ETS, virové infekce.
R. J. Sram 2013
Znečištěné ovzduší ovlivňuje metylaci DNA u dětí
Studované skupiny Celkem 200 dětí (7-15 let): - 100 - Ostrava Bartovice a Radvanice - 100 – Prachaticko - odběr krve - březen 2010
Znečištění B(a)P – 3/2010 - stacionární monitoring:
10.1 ng/m3
-
1.8 ng/m3 Výsledky
Analýza 27 578 metylovaných míst ve více než 14 000 genech 9 916 míst bylo rozdílně metylovaných
PERSONÁLNÍ ODBĚRY OSTRAVSKO 11. – 28. 1. 2010
B[a]P
R. J. Sram 2013
14.6
3 ng/m
Koncentrace B[a]P ze stacionárního měření HiVol v Ostravě, Karviné, Praze a Třeboni 100
1/2010 Ostrava-Bartovice
90
12/2009 Karviná 3/2010 Ostrava-Poruba
80
2/2010 Praha-Libuš (PM10)
ng/m3
70
12/2009 Třeboň
60 50 40 30 20 10 0 1
3
5
7
9
11
13
15
dny R. J. Sram 2013
17
19
21
23
25
27
29
31
PROGRAM OSTRAVA - NOVÉ POZNATKY Adaptivní odpověď lidského organismu na zátěž k-PAU ze znečištěného ovzduší Jako reakce na znečištění ovzduší jsou u Ostravanů exprimované specifické geny, které přispívají se snížení negativního dopadu znečištění na genetický materiál (adaptivní odpověď). Rozdílná exprese genů u dobrovolníků v Ostravě a Praze může naznačovat i rozdílné spektrum znečišťujících látek. Naše laboratoř jako první ukázala, že lidský organismus je schopen reagovat na velmi vysoké koncentrace k-PAU a dalších škodlivých látek adaptivní odpovědí, která je však z dlouhodobého hlediska pro organismus škodlivá. R. J. Sram 2013
ArcelorMittal, Hamilton Canada
kPAU (B[a]P R. J. Sram 2013
1 – 16 ng/m3 3 0.2 – 2 ng/m )
R. J. Sram 2013
ZNEČIŠTĚNÍ OVZDUŠÍ V ČR (HODNOCENÍ RIZIKA)
1) Koncentrace B[a]P > 1 ng/m3/rok (standard EU) jsou dlouhodobě překračovány u 60% populace ČR 2) Proto lze zátěž populace B[a]P považovat za nejvýznamnější riziko znečištěným ovzduším v ČR 3) Pro většinu oblastí ČR představují největší zátěž B[a]P lokální topeniště, v Praze doprava, pro MSK průmyslové zdroje 4) Zdravotní rizika znečištěného ovzduší na zdraví populace by měla být hodnocena dle koncentrace B[a]P a nikoliv PM10
R.J.Sram 2013
ZNEČIŠTĚNÍ OVZDUŠÍ V ČR (HODNOCENÍ RIZIKA)
5) Novým poznatkem jsou výsledky, které prokazují vliv B[a]P na
deregulaci genů u novorozenců (specificky genů ovlivňujících imunitu)
6) Prokázaným důsledkem současného znečištění ovzduší je zvýšená nemocnost dětí předškolního věku, asthma bronchiale u dětí a kardiovaskulární úmrtnosti
7) Zvýšené koncentrace B[a]P budou nepříznivě ovlivňovat současné a příští generace
8) Proto by měl být přijat komplexní výzkumný program, který bude analyzovat vliv znečištěného ovzduší na populaci Moravskoslezského a Ústeckého kraje a navrhnout opatření, která by mohla zátěž populace snížit
R.J.Sram 2013
PODĚKOVÁNÍ Podpořeno granty MŽP ČR Projekt AIRGEN (SP/1b3/8/08) MŠMT ČR Projekt ENVIRONGEN (2B06088) GAČR #P503/11/0084 GAČR #P30113-13458S
R.J.Sram 2013
