BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium
Bioteknologi
dan
Laboratorium Pembenihan Ikan dan Kolam Percobaan Ciparanje untuk penelitian pendahuluan pada bulan Februari sampai dengan Maret 2013. Penelitian utama dilaksanakan di Laboratorium Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran pada bulan April sampai dengan Juni 2013. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan – bahan Penelitian 1. Benih Lele Benih lele yang digunakan dalam penelitian ini adalah benih lele sangkuriang berasal dari petani lele di Sumedang dengan ukuran 7-10 cm sebanyak 530 ekor. Penelitian pendahuluan menggunakan 150 ekor benih lele Penelitian utama menggunakan 380 ekor 2. Kulit Buah Manggis Kulit buah manggis yang digunakan berasal dari Toko Babah Kuya, Jalan Pasar Barat (belakang Pasar Baru Bandung) dalam bentuk tepung halus sebanyak 1 kg. 3. Bakteri Aeromonas hydrophila Bakteri yang digunakan adalah Aeromonas hidrophila dengan kode isolat AHL-13 berasal dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor. 4. Medium Bakteri Media yang digunakan untuk kultur bakteri dan uji patogenitas adalah Triptic Soy Agar (TSA) merk dagang DIFCO dengan dosis pembuatan 40 gram/L akuades. Pembuatan medium bakteri dapat dilihat pada (Lampiran 1). 5. Akuades Akuades digunakan sebagai bahan pelarut simplisia kulit manggis sebanyak 5L. 16
17
6. NaCl Fisiologis NaCl fisiologis digunakan sebagai larutan suspensi bakteri sebanyak 900 mL. 7. Pakan Pakan yang digunakan merupakan pakan komersil tipe 781 merk Hi-Pro-Vite sebanyak 2 kg.
3.2.2
Alat – alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
Akuarium sebagai wadah penelitian sejumlah 15 buah, masing-masing berukuran 38cm x 23cm x 20 cm.
Kolam beton volume 1000 L digunakan untuk penampung stok benih
Aerator, selang aerasi dan batu aerasi untuk memasok O2 pada setiap akuarium dan bak fiber
Serokan sebanyak 1 buah untuk mengambil benih lele
Timbangan digital merk Precise dengan ketelitian 0,001 g untuk menimbang berat benih dan tepung kulit buah manggis
Tabung erlemeyer merk Herma sebanyak 15 buah sebagai wadah tepung kulit buah manggis
Autoclave untuk mensterilkan media bakteri dan peralatan lainnya
Hot plates untuk memanaskan media bakteri
Magnetic stirrer untuk mengaduk larutan media bakteri
Petri dish merk Pyrex sebanyak 10 buah sebagai wadah media agar
Jarum ose sebanyak 1 buah untuk mengambil bakteri yang akan dikulturkan.
L glass untuk meratakan bakteri
Kertas saring Whatman no. 42 dengan diameter 5 mm yang berfungsi sebagai kertas cakram untuk menentukan zona bening
Parafilm sebagai segel cawan petri untuk mencegah kontaminasi
Pembakar bunsen untuk mensterilkan udara pada saat inokulasi bakteri
18
Inkubator untuk inkubasi bakteri
Jangka sorong digital dengan ketelitian 0,1 mm sebanyak 1 buah untuk mengukur zona bening yang terbentuk
Laminar flow sebagai ruang untuk menginokulasi bakteri
Vortex mixer untuk homogenisasi larutan kulit buah manggis
Mikro pipet merk Eppendorf dengan ketelitian 100 μL-1000μL untuk mengambil larutan bakteri
Spektofotometer Genesys 10 UV untuk mengukur kepadatan bakteri dalam larutan
Tabung falcon untuk membuat larutan bakteri Aeromonas hydrophila
Rak tabung reaksi untuk tempat menyimpan tabung reaksi
Kapas untuk menutup tabung reaksi
Alumunium foil untuk membungkus peralatan yang akan digunakan sebelum disterilisasi
Plastik tahan panas untuk membungkus peralatan yang akan di autoclave
Tabung reaksi merk Pyrex sebanyak 5 buah sebagai wadah larutan kulit buah manggis sesuai konsentrasi uji
Petri dish merk Pyrex sebanyak 5 buah sebagai wadah uji daya hambat bakteri
Cuvette plastik ukuran 2 mL sebanyak 10 buah untuk kelengkapan analisis spektofotometer
Suntikan 0,1 mm untuk menginfeksikan bakteri pada benih lele
DO meter merk Hanna HI-3810 untuk mengukur oksigen terlarut
pH meter merk Lutron pH-/44 untuk mengukur derajat keasaman
Termometer dengan ukuran 00C - 1000C sebanyak 1 buah untuk mengukur suhu air
Ammonia Test Kit untuk mengukur amonia terlarut.
19
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima perlakuan dan tiga ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah pengobatan benih lele dengan cara direndam dengan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis selama 48 jam, setiap akuarium diisi dengan 20 ekor benih lele. Berdasarkan hasil uji in vitro memperlihatkan bahwa konsentrasi 1000 ppm memberikan zona hambat bakteri Aeromonas hydrophila sebesar 8,32 mm, sedangkan pada konsentrasi 5000 ppm memberikan zona hambat sebesar 8,73 mm. Hasil uji LC50 dan LC1 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Enviromental Protection Agency (US EPA). Hasil uji LC50 48 jam memperlihatkan bahwa konsentrasi larutan filtrat sebesar 5287,982 ppm dapat mematikan benih lele sebesar 50 % selama 48 jam sedangkan LC1 48 jam memperlihatkan bahwa konsentrasi larutan sebesar 1690,639 ppm dapat mematikan benih lele sebesar 1 %. Berdasarkan uji in vitro dan LC1, maka perlakuan yang digunakan adalah
Perlakuan A : tanpa direndam larutan filtrat kulit buah manggis (kontrol) 0 ppm
Perlakuan B: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 1000 ppm
Perlakuan C: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 1500 ppm
Perlakuan D: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 2000 ppm
Perlakuan E: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 2500 ppm
20
Model umum rancangan yang digunakan : Xij = µ + τj + Ɛij
(Gasperz 1991)
Keterangan Xij = hasil pengamatan pada perlakuanke-i ulangan ke- j µ = rata-rata umum τj = pengaruh perlakuan ke-i Ɛij = pengaruh faktor random perlakuanke-i ulangan ke- j 3.4 Tahapan Penelitian Tahapan penelitian yang pertama dilakukan adalah penelitian pendahuluan yang meliputi uji in vitro dan LC50 48 jam dan selanjutnya dilakukan penelitian utama. Uji in vitro bertujuan untuk mengetahui daya hambat bakteri yang disebabkan perendaman dengan menggunakan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis sedangkan untuk mengetahui tingkat toksisitas larutan filtrat terhadap benih lele dilakukan uji LC50 48 jam.
3.4.1 Penelitian Pendahuluan 1. Pembuatan larutan filtrat kulit buah manggis Pembuatan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis dilakukan dengan metode Hot Water Extract (Lampiran 2). Langkah – langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Ditimbang simplisia bubuk kulit buah manggis sesuai konsentrasi yang diinginkan 2. Dimasukkan simplisia pada akuades steril dalam erlenmeyer dengan volume 250 mL. 3. Hasil campuran bubuk dengan akuades kemudian dipanaskan selama 15 menit pada suhu 50 0C di atas hot plates dengan pengaduk magnetic stirrer (tiap - tiap dosis) 4. Diamkan ± 5 menit untuk diendapkan kemudian disaring dengan kertas saring kasar sampai diperoleh larutan yang digunakan untuk pengobatan
21
2. Uji Toksisitas (Uji LC50 48 Jam) Uji LC50 larutan filtrat kulit buah manggis dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi larutan herbal dengan mortalitas benih lele sebanyak 50% selama 48 jam. Langkah – langkah yang dilakukan untuk uji toksisitas adalah sebagai berikut :
Sebelum dilakukan uji LC50, benih lele terlebih dahulu diaklimatisasi selama 7 hari dalam bak fiber dengan volume 100 liter diberi pakan pelet secara ad libitum
Akuarium dengan alat aerasi dipersiapkan
Akuarium diisi air sebanyak 15 L dengan padat tebar 15 ekor/akuarium
Benih lele direndam larutan filtrat simplisia kulit buah manggis sesuai perlakuan (Lampiran 3)
Mortalitas ikan diamati dan dihitung pada 24 jam pertama dan kedua
Kelangsungan hidup ikan dalam uji LC50 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Enviromental Protection Agency (US EPA). Hasil uji LC50 48 jam pada benih lele ini didapatkan nilai 5287,982 (Lampiran 4).
3. Uji in vitro Uji zona daya hambat (in vitro) dilakukan untuk mengetahui kemampuan dari larutan filtrat kulit buah manggis sebagai antibakteri dalam menghambat pertumbuhan Aeromonas hydropilla. Hasil uji in vitro didapatkan dari adanya zona bening di sekitar kertas saring whatman yang telah direndam larutan.
Peralatan dan bahan yang digunakan untuk uji zona daya hambat disterilisasi terlebih dahulu dengan autoclave.
Metode pengerjaan dilakukan secara steril di ruang laminar flow untuk mencegah kontaminasi.
Kepadatan bakteri sebesar 108 CFU/mL diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 µm sampai diperoleh nilai OD (Optical Density) sebesar 0,235 yang setara dengan 108 CFU/mL.
22
Kertas cakram dipersiapkan dengan diameter 5 mm yang telah direndam pada larutan kulit manggis selama 24 jam kemudian diletakkan di atas media petri dish agar TSA yang telah diinokulasi dengan bakteri Aeromonas hydrophila sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan 108 CFU/mL.
Petri dish kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 350C dalam inkubator.
Setelah diinkubasi, pengamatan dilakukan dan pengukuran zona hambat dengan melihat zona bening dari setiap kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Semakin besar zona hambat, mengindikasikan semakin besar kemampuan
larutan
filtrat
kulit
buah
manggis
dalam
menghambat
pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila. Diameter zona hambat yang dihasilkan pada uji ini kemudian diamati (Lampiran 5).
3.4.2 Penelitian Utama Prosedur yang dilakukan selama penelitian adalah sebagai berikut : 1. Persiapan akuarium sebanyak 15 buah. 2. Air yang akan digunakan didiamkan selama sehari di bak penampungan air sebelum dimasukkan ke dalam akuarium 3. Akuarium diisi dengan air sebanyak 15 L, yang berasal dari bak penampungan air. 4. Aerasi bak penampungan air dan akuarium. 5. Ikan terlebih dahulu diaklimitasi selama seminggu. 6. Penempatan akuarium perlakuan secara acak (Lampiran 6). 7. Ikan uji dimasukkan ke dalam akuarium yang telah disiapkan dengan kepadatan 20 ekor per wadah. 8. Penginfeksian bakteri Aeromonas hydrophila dengan kepadatan 108 CFU/ml (Lampiran 7) sebanyak 0,1 mL dengan cara menyuntikan pada tubuh benih secara intramuscular. 9. Larutan filtrat kulit buah manggis dipersiapkan sesuai perlakuan 10. Pengamatan gejala klinis. Jika gejala klinis telah nampak, baru dilakukan pengobatan dengan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis.
23
11. Setelah 48 jam perendaman, air pemeliharaan diganti dengan air baru tanpa diberikan larutan simplisia kulit buah manggis. 12. Penyiponan dan penggantian air dilakukan setiap hari selama penelitian. 13. Pemberian pakan pelet komersil secara adlibitum dengan frekuensi dua kali sehari yaitu pukul 08.00 dan 16.00 WIB. 14. Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama masa pengobatan (2 hari) dan masa pemeliharaan (21 hari).
3.5 Paramater Pengamatan 3.5.1 Gejala klinis Gejala klinis yang diamati adalah kerusakan
tubuh bagian luar dan
perubahan tingkah laku benih yang mencakup respon terhadap pakan uji, keseimbangan tubuh ikan dan pergerakan renang (pasif/aktif).
3.5.2 Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup benih benih lele dihitung berdasarkan kelangsungan hidup benih lele selama pengobatan dengan larutan simplisia kulit buah manggis setelah 23 hari pengamatan. Rumus yang digunakan dengan menggunakan rumus Effendie (1997) : 𝑵𝒕
SR = 𝑵𝒐x 100% Keterangan : SR : kelangsungan hidup benih (%) Nt : jumlah benih hidup akhir pengamatan (ekor) No : jumlah benih hidup awal pengamatan (ekor)
3.5.3 Kualitas Air Parameter kualitas air yang diamati adalah suhu, DO (disolved oxygen), pH, dan amonia. Parameter ini diamati selama masa pemeliharaan dan masa pemeliharaan setelah pengobatan. Pengamatan amonia dilakukan sebanyak tiga kali yaitu pada hari ketujuh, hari keempat belas dan hari kedua puluh satu setelah pengobatan.
24
3.5.4 Analisis Data Data kelangsungan hidup benih lele yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) atau uji F. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan dilakukan uji lanjutan dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan dengan taraf kepercayaan 95 % (Gasperz 1991). Data gejala klinis dianalisis secara deskriptif.
