Az elektromágneses spektrum
400 nm
750 nm
Jenei A. (2009/10)
Hőmérsékleti sugárzás 1 Minden test anyagi minőségétől független, csak a test hőmérséklete által meghatározott spektrumú elektromágneses sugárzást bocsát ki, melyet hőmérsékleti sugárzásnak nevezünk. Kirchhoff sugárzási törvénye:
M λ ,i
α λ ,i
=
M λ, j
αλ, j
Mλ,i - az ‘i’ test által λ hullámhosszon kisugárzott teljesítmény αλ,i – az ‘i’ test abszorpciós tényezője (a test által enyelt és a testre eső összes sugárzási energia hányadosa
Ha egy test adott hullámhosszon erősebben sugároz, akkor az abszorpciója is nagyobb. Azt a testet, melynek abszorpciós tényezője α=1 (tehát a ráeső összes sugárzást elnyeli), abszolút fekete testnek nevezzük.
M λ ,i
α λ ,i
=
M λ , fekete
α λ , fekete
=
M λ , fekete 1
= M λ , fekete
Ezért az abszolút fekete test sugárzási törvényének ismeretében a hőmérsékleti sugárzás spektruma tetszőleges testre meghatározható az abszorpciós tényező ismeretében.
Jenei A. (2009/10)
Hőmérsékleti sugárzás 2 6x10-17
Intenzitás
Stefan-Boltzmann törvény:
M fekete (T ) = σT 4
4x10-17 2000K
Wien-féle eltolódási törvény:
2x10-17
λmaxT = állandó = 2.9 ⋅10 −3 m ⋅ K
1000K 0 0
1014
2x1014 3x1014 4x1014 Frekvencia
A spektrum magyarázata:
2x10-17
e-
eRayleigh-Jeans
Intenzitás
2x10-17
10-17
Planck
5x10-18
0 0
1014
2x1014
Frekvencia
f1
f2
A testben levő elektronok oszcillációja idézi elő a hőmérsékleti sugárzást.
Két ellentétes törvényszerűség játszik szerepet: 1. ► a frekvencia növelésével növekszik az Rayleigh-Jeans oszcillátor állapotainak (módusainak) törvény: a frekvencia száma növelésével ► minden módusra azonos (kT) energia arányosan nő az esik (ekvipartíció tétele) intenzitás 2. ► az oszcillátorok energiája csak hf 3x1014 kvantumokkal változhat ► minél magasabb az oszcillátor energiája (frekvenciája), annál alacsonyabb az állapot betöltöttsége (Boltzmann eloszlás) 1+2 → Planck-féle sugárzási törvény
Jenei A. (2009/10)
Heisenberg-féle bizonytalansági reláció Egy részecske helye (x) és impulzusa (px) csak korlátozott pontossággal határozható meg egyszerre.
∆x ⋅ ∆p x ≥ h Hasonló összefüggés vonatkozik az energia-idő párra is: egy állapot energiája és élettartama egyszerre nem határozható meg tetszőleges pontossággal.
∆E ⋅ ∆t ≥ h A Heisenberg-féle bizonytalansági reláció a részecske hullám/kvantum természetének következménye. Egy vizsgált paraméter meghatározásának hibaforrásai: 1.
Heisenberg-féle határozatlansági reláció
2.
a mérés során a mérőműszer megváltoztatja a vizsgált rendszert
3.
a mérőműszer tökéletlensége
ad. 2
A I=?
Werner Heisenberg (1901 - 1976)
Mérési hiba. Nincs összefüggésben a Heisenbergféle határozatlansági relációval.
Mivel az árammérő ellenállása nem nulla, a mért áramerősség nem azonos azzal, ami az árammérő nélkül fennállt.
A Heisenberg-féle bizonytalansági reláció egyik következménye, hogy a kvantumvilág nem determinisztikusan, hanem statisztikusan működik (pl. az interferencia-mintát pontosan meg lehet jósolni, de azt, hogy az egyes fotonok pontosan milyen úton mennek, azt nem). Ezt az ún. koppenhágai értelmezést Einstein nem fogadta el („I cannot believe that God would choose to play dice with the universe”). Jenei A. (2009/10)
Atomi energiaszintek: a Bohr modell A kötött (atomi és molekuláris) elektronnak csak meghatározott energiája lehet: kvantált (diszkrét) energiaszintek szabad (nem kötött) elektronok • nulla • nem kvantált potenciális energiával
ionizációs energia (kilépési munka)
atommag
ionizáció
teljes energia
mozgási energia
E1
abszorpció
atomi (kötött) elektronok • negatív • kvantált potenciális energiával
E2 E3 emisszió
E foton = hf = E2 − E1
Az átmenetek hullámhossza:
1 1 = R 2 − 2 cm −1 λ n1 n2 1
R = Rydberg const. Jenei A. (2009/10)
A kvantált energiaközlés első bizonyítéka: Frank-Hertz kísérlet -0.5V A higany atom gerjesztési energiája: 4.9 eV
+
_
háló 0 katód Efoton=4.9eV Ekin=4.9 eV
Hg
Hg
Hg anód (kollektor)
_ Hg
Ekin<4.9 eV
• Ha az elektron kinetikus energiája kisebb, mint 4.9 eV, az elektron nem veszt energiát.
U=8V
U=2·4.9=9.8V
Ekin 4.9 eV
áram
• Ha az elektron kinetikus energiája 4.9 eV, a higany gerjesztődik, az elektron kinetikus energiája nullára csökken (megáll).
U=2V U=4.9V
távolság katód-háló fesz. 5V
10 V
15 V
Jenei A. (2009/10)
A hidrogén atom spektruma kontinuum
E6 E5 E4 E3 E2 E1 Lyman
Balmer
Paschen
emisszió abszorpció
ugyanannál a hullámhossznál ATOMOKNÁL, de NEM MOLEKULÁKNÁL
abszorpciós spektrum emissziós spektrum abszorpció, gerjesztés
relaxáció, emisszió Jenei A. (2009/10)
Molekulák energiaszintjei és spektruma b
További energiatárolási lehetőségek a. b.
a b
Az atomok vibrációja Az egész molekula rotációja
Következmény: az elektron energiaszintek mellett vibrációs és rotációs energiaszintek megjelenése. Újabb átmenetek megjelenése a spektrumban. r=4 3 2 1 0
v=1
r=4 3 2 1 0
v=0
Az átmenetek nagy száma miatt a molekulaspektrumok összetettek. ∆r = +1 ∆r = −1 Szelekciós szabályok: nem minden átmenet megengedett. ∆r = 0
Jenei A. (2009/10)
Energiaszintek
Keskeny vonalakból álló spektrum csak a gázfázisban észlelhető
egyedi, izolált molekula
gyenge erős kölcsönhatás kölcsönhatás kölcsönható molekulák
Spektrum
Az egyes spektrumvonalak (szürke) helyett a szélesebb vonalakat detektáljuk.
Az egyes spektrumvonalak helyett egy összefüggő sávot látunk.
λ
λ
λ Jenei A. (2009/10)
Az abszorpció és emisszió (fluoreszcencia) mérése
fénynyaláb
fotométer
Io
I
detektor
fényforrás monokromátor, prizma v. filter
küvetta
gerjesztő fény
fluoriméter monokromátor, prizma v. filter
emittált fény
detektor
L
I = I o ⋅10 −ε c L Io lg = ε c L I ε – moláris abszorpciós koefficiens c – moláris koncentráció
Jenei A. (2009/10)
Bevezetés a fluoreszcenciába
Jenei A. (2009/10)
• Mi a fluoreszcencia? – a fluorofór molekula gerjesztett állapotból történő visszatérése – foton Abszorpció(1) eredményeként jön létre a folyamat – gerjesztett szingulett állapothoz vezet, S1 – S1 állapotból szubnanoszekundumos relaxáció (2) következik – melyet spektrálisan a vörös hullámhossztartomány (3) felé eltolt fényemisszió követ (Stokes féle eltolódás) • a Stokes féle eltolódás teszi a fluoreszcenciát érzékeny spektroszkópiás technikává
Jenei A. (2009/10)
Jablonski diagram internal Belső konverzió conversion
Gerjesztett Excited Singlet Manifold szingulett állapot
S2
•
Excited Triplet Triplett állapot
•
•
S1
Manifold
kisc k -isc
T1 k nr k k' nr f fluorescence fluoreszcencia
kp
phosphorescence
foszforeszcencia
Intersystem crossing Triplett állapot
S0
Singlet Ground State szingulett alapállapot
Belső konverzió Kasha szabály
Triplett állapot foszforeszcencia; szignifikánsan hosszabb élettartam Jenei A. (2009/10)
Relaxációs lehetőségek Magasabb E és vibrációs állapot Legalacsonyabb E szingulett Triplett állapotba történő Abszorpció
∆E
„Tiltott átmenet”
alapállapot fluoreszcencia
foszforeszcencia
késleltetett fluoreszcencia
Az első szingulett gerjesztett állapotból való visszatérésre többféle alternatíva kínálkozik a molekula számára Jenei A. (2009/10)
A különböző relaxációs folyamatok élettartamai
Jenei A. (2009/10)
szingulett állapot
triplett állapotok
Jenei A. (2009/10)
Jenei A. (2009/10)
1. gerj. állapot
Intenzitás
alapállapot
Hullámhossz Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia paraméterek Ahhoz, hogy karakterizáljuk egy ismeretlen molekula rendszer fotoindukált emisszióját, meg kell határoznunk a hullámhossz függvényében • • • •
az abszorpció és emisszió spektrális eloszlásait, a kvantumhatásfokot a gerjesztett állapot élettartamát az emittált fluoreszcencia polarizáltsági fokát Gregorio Weber, Meth. Enzym. 278, p. 1 (1997)
•
spektrális eloszlás – Kibocsájtási (emissziós) spektrum: Rögzített gerjesztési hullámhossz mellett mérjük a fluoreszcencia intenzitás hullámhossz függését – Gerjesztési (excitációs) spektrum: Rögzített emissziós hullámhossz mellett mérjük a gerjesztési spektrumot (hullámhossz függvényében) : általában ua. mint az abszorpciós spektrum
Jenei A. (2009/10)
Normalizált fluoreszcencia intenzitás Normalized Fluo. Intensity ill. Abszorbancia
Spektrális eloszlás
ECFP chromophore
1.00
434 nm exc.
500 nm det.
0.80
0.60
Tryptophan 0.40
0.20
0.00 250
300
350
400
450
500
550
600
Wavelength [nm] Hullámhossz [nm]
Jenei A. (2009/10)
Abszorpciós spektroszkópia abszorbeáló c koncentrációjú közeg
I = I 0 10 −ε ( λ ) cl Lambert-Beer
úthossz l
I T= I0
I A = − log T = − log I0
Transzmittancia
Abszorbancia
A = − log T = ε ( λ ) cl Jenei A. (2009/10)
Spektrális eloszlások meghatározása Spektrofotométer
fényforrás Monokromátor
Minta
Detektor
Fluoreszcencia luoreszcencia gerjesztés
Fluoreszcencia Fluores ia emisszió
300
350
400
450
500
550
600
Hullámhossz, nm
Jenei A. (2009/10)
Spektrális eloszlások meghatározása Minta Spektrofluoriméter fényforrás Monokromátor
Fluoreszcencia luoreszcencia gerjesztés
Fluoreszcenc cencia emisszió
300
350
400
450
500
550
Detektor
600
Hullámhossz, nm
Jenei A. (2009/10)
Fontos Fluoreszcencia paraméterek •
Kvantumhatásfok – a festék emissziós képességének jellemzője
kf # emittált foton fluor. átm. v. sz. Q = Q= Q= k f + kic + kisc # abszorbeált foton összes átm. v. sz. •
Intenzitás – egyenesen arányos az anyag abszorpciós képességével (extinkciós együttható, ε) – Kvantumhatásfok, Q
F = I 0ε [c]lQ
teljes fluoreszcencia
ahol I0 a belépő gerjesztő fény intenzitása, – l a gerjesztési úthossz – [c] festék (fluorofór) koncentráció Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia élettartamok az összes kompetáló folyamat befolyásolja a mérhető élettartamot.
dN = − N ( k f + k ic + k isc ) dt dt fluoreszcencia intenzitás
gerjesztő impulzus
N = − N 0e
−( k + k + k ) f
ic
isc
τ int = 1 (k f + k ic + k isc ) Q = k fτ
Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia élettartamok • Fluoreszcencia élettartam (τ) karakterisztikus idő melyet a fluorofór a gerjesztett állapotban tölt. τ int = 1/(k f + kic + kisc )
• A gerjesztett állapotban töltött idő alatt a molekula a környezetével számos kölcsönhatáson megy át. – – – – • •
kollíziós kioltás fluoreszcencia energia transzfer intersystem crossing rotációs mozgás
Homogén rendszer esetén (fluorofór + oldat) az élettartam egy komponensből áll Heterogén rendszerek esetén többkomponens mérhető
Jenei A. (2009/10)
Jenei A. (2009/10)
Fluorofórok • Mi az a fluorofór? – olyan molekula amelyik „fluoreszkál” – néhány aminosav, különösen Trp, Tyr és Phe
Jenei A. (2009/10)
Fluorofórok-2 •
Közönséges fluorofórok – exogén festékek Fluorescein, Rhodamine, Acridine Orange, Ethidium Bromide, Cy – endogén fluorofórok - NADH autofluoreszcencia, stb.
FLUORESCEIN Molekuláris képlet: C20H12O5 Molekula tömeg: 332.31 Jenei A. (2009/10)
Flurofórok-3 •
Fehérjék – Phycobiliproteins - phycoerythrin, allophycocyanin – Green Fluorescent Protein - GFP
•
Új fehérjék – nanokristályok (core/shell quantum dots)
Jenei A. (2009/10)
Gyakran használt fluorofórok
Jenei A. (2009/10)
Fluorofórok néhány alkalmazása
• Immunofluoreszcencia • ion szenzitív festékek -K+, Na+, Ca2+ specifikus markerek -pH indikátorok
• membránpotenciál – megnövekedett intracelluláris fluoreszcencia
• DNS festékek • fehérje fluoreszcencia meghatározási módszerek
Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia mérése
• Spektrofluoriméter – excitációs és emissziós spektrum – monokromátor – oldatok vizsgálata (küvettában)
• Fluoreszcens mikroszkóp – fluoreszcencia eloszlás – biológiai rendszerek (sejtek stb.) vizsgálata. – optikai szűrők használata
Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia mérése
Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia mérése
Jenei A. (2009/10)
Optikai szűrők kibocsátott fény Tipikus filter elrendezés mikroszkópban gerjesztő fény
minta Jenei A. (2009/10)
Optikai szűrők
Jenei A. (2009/10)
Optikai szűrők - 2
Jenei A. (2009/10)
Fényforrások
Jenei A. (2009/10)
Optikai szűrők kiválasztása Wild Type GFP
Fluorescence Excitation
Fluorescence Emission
300
350
400
450
500
550
600
Wavelength, nm
Chroma Technology 32000 WTGFP Bandpass Filter Set Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcens képalkotás
•
FITC-el (fluorescein isothiocyanate) és Rhodamine-phalloidin-nal jelölt sejt a microtubulusok és az aktin filamentumok látahtóvá tételére. Jenei A. (2009/10)
Fotohalványítás Photobleaching (fading) • fotokémiai destrukció • fotokémiai reakció (kémai sérülés, kovalens változás) a gerjesztett állapot során ► a fluorofór irreverzibilisen elveszíti a fluoreszcens tulajdonságát ► csökken az alapállapotú fluorfórok száma • in most cases it is linked to a transition from the excited singlet state to the excited triplet state • photobleaching aránya függ az intenzitástól és a gerjesztés idejétıl oxigénkoncentrációtól a fluorofór tulajdonságaitól • a gerjesztési és emissziós ciklusok száma fluorofóronként állandó • hátránya (pld. Mikroszkópos technikák)
Jenei A. (2009/10)
KÉK – nucleus (Hoechst 33258; VÖRÖS – mitochondria (MitoTracker Red); Zöld – actin filaments (Alexa488-phalloidin)
http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html Jenei A. (2009/10)
Jenei A. (2009/10)
A biológiai alkalmazásoknál használt fluorofórok méretei
Nat. Biotechnol., 21, 1387.
Jenei A. (2009/10)
Aequorea victoria (jellyfish)
Green Fluorescent Protein (GFP)
• 238 aa; 26.9 kDa • it was first purified from Aequorea victoria and its properties studied by Osamu Shimomura • Douglas Prasher realized the potential of GFP as a tracer molecule; reported the cloning and the nucleotide sequence of wtGFP • Roger Y. Tsien is responsible for much of our understanding of how GFP works and for developing new techniques and mutants of GFP • Martin Chalfie, Osamu Shimomura and Roger Y. Tsien share the 2008 Nobel Prize in Chemistry for their discovery and development of the green fluorescent protein http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm Jenei A. (2009/10)
Jenei A. (2009/10)
Jenei A. (2009/10)
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescentproteins/fluorescentproteinshome.html
Jenei A. (2009/10)
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm Jenei A. (2009/10)
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET) D* A
A*
D* Donor és akceptor távol egymástól - No FRET
•
• • • •
Donor és akceptor közel egymáshoz - FRET
fénykibocsátás nélküli (elektromágneses dipólus-dipólus) átmenet a gerjesztett kromofór (donor) felöl a receptor molekula (akceptor) fele. dinamikus „Förster” transzfer folyamat meglehetősen távolságfüggő ∝ 1/R6 hatékony eszköz molekula asszociációk, fehérje-fehérje, receptor-ligand kölcsönhatások vizsgálatára FRET távolság tartománya: 2-10 nm Jenei A. (2009/10)
FRET Fotofizikai következményei D* A* •
•
FRET esetén a donormolekula számára létezik egy alternatív relaxációs lehetőség
Energia Transzfer esetén – Donor gerjesztett állapotának (D*) élettartama csökken – Donor fluor. intenzitása csökken – Donor photobleaching (fotohalványítás) sebességi állandója csökken – Akceptor fluoreszcencia intenzitása ( ha a donor jelen van) növekszik Jenei A. (2009/10)
Applications of FRET Protease sensor:
Calcium sensor:
FRET YFP
CFP CFP
YFP - Ca2+ e.g. caspase sensitive linker
+ 4 Ca2+
FRET
CFP
CFP
no FRET YFP Nature, 388, 882. Jenei A. (2009/10)
Applications of FRET Tyrosine phosphorylation sensors:
Nature Biotech., 20, 287.
Jenei A. (2009/10)
FRET változás különböző molekulák között akceptor
FRET donor
D FRET
A D A
A D
? idő
1. Mindegyik donorakceptor pár közelebb kerül egymáshoz 2. csak néhány donorakceptor pár kerül nagyon közel egymáshoz, míg a többi relatív helyzete nem változik. Jenei A. (2009/10)
FRET detektálása • Spektrális változások – akceptor fluoreszcencia intenzitása növekszik – donor fluoreszcencia csökken
• Fluoreszcencia élettartam – Csökkenő donor oldali élettartam
•Donor Photobleaching (fotohalványítás) – a donor molekulák un. photobleaching sebességi állandója akceptor jelenlétében csökken
•Akceptor Photobleaching – erős, akceptort gerjesztő fényt alkalmazva akceptor mentes terület –megnövekedett donor fluoreszcencia
Jenei A. (2009/10)
Alkalmas FRET festékpárok kiválasztása ECFP/EYFP
Normalized Fluo. Intensity
1.2 ECFP, ex ECFP, em EYFP, ex. EYFP, em
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 350
400
450
500
550
600
650
Wavelength, nm
Jenei A. (2009/10)
A Förster típusú energiatranszfer hatásfok távolságfüggése
R06 E= 6 6 R0 + R
Jenei A. (2009/10)
Raman szórás (Raman spektroszkópia) A fotonok energiája megváltozik (csökken vagy nő) amiatt, hogy a foton kölcsönhat a molekula vibrációs vagy rotációs energiaszintjeivel. A vibrációs vagy rotációs energiaszinteket a frekvencia megváltozása alapján lehet mérni:
f szórt = f 0 ± ∆f
Stokes:
fo
f szórt = f 0 − ∆f
fo-∆f ∆f foton
foton Anti-Stokes:
f szórt = f 0 + ∆f
fo
fo+∆f ∆f
foton
foton
A Stokes vonalak sokkal erősebbek. Jenei A. (2009/10)
