36
Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. Pembuatan Larutan Stok
Tris HCL 1 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan sampai homogen, selanjutnya ditambah 4,2 ml HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
EDTA 0,5 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18,612 g dan NaOH 2.0 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambah 80 ml aquades. Selanjutnya, ditambahkan HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
NaCl 5 M (100 ml) : Timbang NaCl sebanyak 29,22 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan aquades hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk. Kemudian volume ditepatkan dengan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.
B. Pembuatan Larutan Bufer
CTAB 2 % (100 ml) CTAB 2 %
= 2 g CTAB
20 mM EDTA
= 8 ml EDTA 0,5 M pH 8.0
100 mM Tris-HCl = 10 ml Tris-HCl 1 m pH 8.0 1,4 M NaCl
= 56 ml NaCl 5 M
0,2 % PVP
= 2 g PVP
0,2 % β-merkaptotanol
Buffer TAE 50 X (100 ml) Tris
= 24,2 g
Asam Asetat Glacial
= 5,7 ml
EDTA 0,5 M pH 8.0
= 10 ml
Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml
Universitas Sumatera Utara
37
Buffer TAE 1 X (1000 ml) Buffer TAE 50 X = 20 ml Aquades
= 980 ml
Kloroform Isoamilalkohol 24:1 (50 ml) Kloroform
= 48 ml
Isoamilalkohol
= 2 ml
Universitas Sumatera Utara
38
Lampiran 2. Komposisi Medium Y3 yang Digunakan Bahan Unsur Kimia
Konsentrasi (mg/L)
Makro Elemen NH4Cl
535,000
KNO3
2020,000
MgSO4.7H2O
247,000
CaCl2. 2H2O
294,000
KCL
1492,000
NaH2PO4
312,000
Mikro Elemen KI
8,300
H3BO3
3,100
MnSO4. 4H2O
11,200
ZnSO4. 7H2O
7,200
CuSO4. 5H2O
0,160
CoCl2. 6H2O
0,240
NaMoO4. H2O
0,240
NiCl2
0,024
Fe2SO4. 7H2O
27,800
NaEDTA
37,300
Vitamin Myoinositol
100.000
Piridixin HCl
0,050
Tiamin HCl
0,500
Glisin
2,000
Asam Amino Glutamin
100,000
Gula
45000,000
Agar
8000
pH
6,0
Universitas Sumatera Utara
39
Lampiran 3. Data Pengamatan Waktu Terbentuknya Organ (HST)
Konsentrasi 2,4-D
Ulangan 1
2
3
4
5
-
-
-
-
-
100 mg/L
105
-
-
-
-
115 mg/L
-
-
153
-
-
120 mg/L
-
-
120
-
-
135 mg/L
-
-
134
-
-
140 mg/L
114
-
-
-
-
0 mg/L
Universitas Sumatera Utara
40
Lampiran 4. Matriks kemiripan genetik berdasarkan coefficient dice
Sampel P0 P1 P2 P3 P4 P5
P0 1.00 0.55 0.58 0.32 0.58 0.50
P1
P2
P3
P4
P5
1.00 0.73 0.64 0.82 0.64
1.00 0.61 0.79 0.73
1.00 0.70 0.58
1.00 0.70
1.00
Universitas Sumatera Utara
41
Lampiran 5. Proses Isolasi DNA
Eksplan 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan bantuan nitrogen cair
Eksplan ditambah kedalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstrasi, 2% β-merkaptoetanol dan 1% PVP
Eksplan ditambah KIAA (24:1) dan disentrifus dengankecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit
Supernatan ditambah 1ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 malam
DNA diendapkan dengan penambahan 1/10 kali volume sodium asetat dan dihomogenkan.
Supernatan dibuang sedangkan pelet diambil dan dibersihkan dengan alkohol 70% sebanyak 2 kali
DNA divakum pada suhu 37oC selama 10 menit. DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides (ddH2O) steril
Untuk menghilangkan kontaminan RNA dari DNA dengan menambahkan µL RNase (20 mg/ml) pada suhu 37oC selama 90 menit
RNase dinonaktifkan pada suhu 70oC selama 3 menit dan disimpan pada suhu -20oC untuk digunakan selanjutnya
Universitas Sumatera Utara
42
Lampiran 6. Uji Kualitas DNA Agarose 1% ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan kedalam chamber berisi buffer TAE 1x
Sample dan loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan perbandingan (5:1)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt
Proses running dimulai selama 45 menit
Universitas Sumatera Utara
43
Lampiran 7. Proses PCR – SSR
Komposisi Master Mix Volume 10 µl : Go Taq® Green 5 µl DNA template 1 µl Primer R (10 pmol/ µl) 1 µl Primer F (10 pmol/ µl) 1 µl Nuclease free water 2 µl
Running PCR sebanyak 35 siklus : Denaturasi awal 95oC 30 detik Denaturasi 95oC 1 menit Annealing (Suhu optimum primer) 55oC dan 58oC 30 detik Extension 72oC 1 menit Post Extension 72oC 5 menit Kondisi akhir PCR 4oC Tak terbatas (∞)
Proses running dimulai selama ± 3 jam
Universitas Sumatera Utara
44
Lampiran 8. Proses Hasil PCR – SSR Agarose 2 gram ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber berisi buffer TAE 1x
Sampel hasil PCR dan marker dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (10:5)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supplay pada tegangan 70 V, 100 mA pada suhu ruang.
Proses running dimulai selama 90 menit
Universitas Sumatera Utara
