A fókuszált ultrahang hatása a glomeruláris ultrafiltracióra Doktori értekezés
Dr. Fischer Krisztina Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezetők: Dr. Szabó András egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Reusz György egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Jolesz Ferenc egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Hivatalos bírálók: Dr. Szabó Tamás egyetemi adjunktus, PhD Dr. Wagner László egyetemi adjunktus, PhD Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Rosivall László egyetemi tanár, PhD, az orvostudományok doktora
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Kovács Gábor, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Szabó László, egyetemi tanár.
Budapest 2009
2
TARTALOMJEGYZÉK
1.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
9
2.
BEVEZETÉS
10
2.1
Az ultrahang és a folyadék kölcsönhatása
11
2.1.1
Hőmérséklet emelkedés
12
2.1.2
Kavitáció
12
2.1.3
Egyéb mechanikai hatások
14
2.1.3.1
Akusztikus áramlás
15
2.1.3.2
Sugárzási erő, vagy sugárzási nyomás
15
2.2
Az ultrahangos erőtér kiváltása, az ultrahang és folyadék kapcsolatának vizsgálata
16
2.2.1
Az ultrahangos erőtér előálltása
16
2.2.1.1
Az ultrahangos erőteret biztosító transzducer anyaga
19
2.2.2
A folyadék jellemzői
19
2.2.3
Az ultrahang és a folyadék kapcsolatának megfigyelése, követése 20
2.3
Mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyagok
23
2.4
A fókuszált ultrahang terápiás felhasználásai
23
2.4.1
Történeti kitekintés
23
2.4.2
A fókuszált ultrahang hőmérsékletemelkedéshez köthető terápiás felhasználásai
24
2.4.3
A fókuszált ultrahang kavitációhoz és egyéb, mechanikai hatáshoz kötehető terápiás felhasználása 25
2.5
A glomeruláris permeabilitás alapjai
28
2.5.1
A glomeruláris barrier részei
30
2.5.1.1
Epitheliáis vagy podocyta réteg
30
2.5.1.2
Glomeruláris bazálmembrán
32
3
2.5.1.3
Endothel réteg
32
2.6
A glomeruláris permeabilitás
33
2.6.1
A víz filtrációjának glomeruláris szerkezeten alapú modellje
34
2.6.2
A glomeruláris filtráció meghatározó tényezői
35
2.6.3
A glomeruláris filtráció szabályozása
36
2.6.4
A glomeruláris filtráció méretszelektivitása
37
2.6.5
A glomeruláris filtráció töltésszelektivitása
38
2.6.6
A podocyták válasz reakciója a mechanikus stresszre
39
2.7
A glomeruláris permszelektivitás vizsgálata dextrán, ficoll vagy globuláris fehérjék segítségével
41
2.8
Proteinúria
42
2.9
A filtrációs modell alkalmazása glomeruláris betegségekre
43
2.10
Összefoglalás
43
3.
CÉLKITŰZÉSEK
44
3.1
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag egyidejű alkalmazásának a glomeruláris filtracióra kifejtett hatásának tisztázása 44
3.1.1
Kis és nagy molekulasúlyú anyagok clearance-ének vizsgálata
44
3.1.2
A tubuláris funkció vizsgálata
45
3.1.3
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott esetleges szövettani eltérések tisztázása
45
3.2
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott, glomeruláris filtrációban bekövetkezett változások alkalmazott ultrahangos energia függésének tisztázása 45
3.3
A fókuszált ultrahang és a mikrobuborék alapú, ultrahangos kontrasztanyag glomeruláris barrierre gyakorolt fizikai hatásának tisztázása
45
ÁLLATOK ÉS MÓDSZEREK
47
4.
4
4.1
Állatok
47
4.1.1
A fókuszált ultrahang hatása a vese permeabilitására
47
4.1.1.1
Az állatok előkészítése, sebészeti beavatkozás, invazív vérnyomásmérés
49
4.1.2
Energia függő glomeruláris filtráció változás fókuszált ultrahang és ultrasonográfiás kontraszt anyag együttes alkalmazása alatt 50
4.2
Módszerek
52
4.2.1
A kísérletek időrendi leírása
52
4.2.1.1
A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára 52
4.2.1.2
Energia függő glomeruláris filtráció változás fókuszált ultrahang és ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes alkalmazása alatt 53
4.2.2
A kezelőasztal
54
4.2.3
A fókuszált ultrahang
54
4.2.3.1
A transzducer
54
4.2.3.2
A szonikációk - A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára
56
A szonikációk – Energia függő glomerularáris filtració változás fókuszált ultrahang és ultrasonográfiás kontraszt anyag együttes alkalmazása alatt
56
4.2.3.4
Az akusztikus energia
57
4.2.4
A képalkotó ultrahang
58
4.2.5
A kezelt vesetérfogat megbecslése
58
4.2.6
Funkcionális vizsgálatok
59
4.2.6.1
Vér és vizeletgyűjtés, a minták feldolgozása
60
4.2.6.2
Glomeruláris méret szelektivitás vizsgálata
60
4.2.6.3
A laborparaméterek mérése
58
4.2.6.4
A glomeruláris filtrációs ráta kiszámítása
59
4.2.6.5
A proteinúria, tubuláris funkció megbecsülése
59
4.2.3.3
5
4.2.7
Szövettani vizsgálatok
59
4.2.7.1
A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára 60
4.2.7.2
A fókuszált ultrahangkezelés mechanikai hatása a glomeruláris barrierre 61
4.2.8
Elektronmikroszkópos vizsgálatok
61
4.2.8.1
A minták előkészitése, fixálása, beágyazása
61
4.2.8.2
Az elektronmikroszkópos feldolgozás
61
4.2.8.3
Az elektromikroszkópos mérések
61
4.2.9
Az adatok statisztikai elemzése
62
4.2.9.1
A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára 63
4.2.9.1.1
A relatív funkcionális paraméter meghatározása, a FUS kezelés hatásának számítása
64
4.2.9.1.2
Power analysis
64
4.2.9.1.3
A normál eloszlás vizsgálata
64
4.2.9.1.4
A páros t-próba
64
4.2.9.1.5
Kétszempontos varianciaanalízis
64
4.2.9.2
A fókuszált ultrahangkezelés mechanikai hatása a glomeruláris barrierre
64
4.2.9.2.1
A relatív kreatinin clearance meghatározása, a kretinin clearance és az alkalmazott FUS energia kapcsolata 64
4.2.9.2.2
A kétmintás t-próba – a podocyta távolság változás vizsgálata
6
64
5.
EREDMÉNYEK
65
5.1
A glomeruláris permeabilitás és a glomeruláris filtráció vizsgálata 65
5.1.1
A glomeruláris permeabilitás vizsgálata
67
5.1.2
A glomeruláris filtráció vizsgálata
69
5.2
A proteinúria és a tubuláris funkció vizsgálata
69
5.2.1
A proteinúria vizsgálata
70
5.2.2
A tubuláris funkció vizsgálata
72
5.3
Szövettani eredmények
72
5.4
A FUS kezelés során tapasztalt akusztikus emisszió
73
5.5
A relatív kreatinin clearance növekedés és az alkalmazott akusztikus energia kapcsolata 75
5.6
Proteinuria és a tubuláris funkció vizsgálata
75
5.7
Az ultrastruktúrális feldolgozás
78
6.
MEGBESZÉLÉS
79
6.1
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú, ultrahangos kontrasztanyag egyidejű alkalmazásának a glomeruláris filtracióra kifejtett hatásának vizsgálata 79
6.1.1
Kis és nagy molekulasúlyú anyagok clearance-nek vizsgálata
81
6.1.2
A tubuláris funkció vizsgálata
82
6.1.3
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott szövettani eltérések vizsgálata
82
6.2
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott, glomeruláris filtrációban bekövetkezett változások, alkalmazott ultrahangos energia függésének tisztázása 83
6.3
A fókuszált ultrahang és a mikrobuborék alapú, ultrahangos kontrasztanyag glomeruláris barrierre gyakorolt fizikai hatásának tisztázása
7
84
7.
KÖVETKEZTETÉSEK
85
8.
ÖSSZEFOGLALÁS
86
9.
SUMMARY
87
10.
TÁBLÁZAT ÉS ÁBRAJEGYZÉK
88
10.1
Táblázatok jegyzéke
88
10.2
Ábrák jegyzéke
89
11.
IRODALOMI HIVATKOZÁSOK
90
12.
ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 107
13.
ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉTŐL FÜGGETLEN, MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 108
14.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
15.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, VAGY KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK KÜLÖNLENYOMATA
8
109
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ADC
Analog-to-digital conventer
analóg-digitális átalakító
FENa%
Fractional Excretion of
frakcionális nátrium exkréció
Sodium FUS
Focused Ultrasound
fókuszált ultrahang
GBM
Glomerular Basement
glomerularis bazálmembrán
Membran GGT
Gamma-Glutamyl-
gamma-glutamil transzferáz
Transferase HE
Hematoxylin & Eosin
Hematoxylin és Eosin
i.m.
Intra Muscular
Intra muszkuláris (injekció)
MRI
Magnetic Resonance
mágneses magrezonancia
Imaging
képalkotás
NFP
Net Filtration Pressure
nettó filtrációs nyomás
PAS
Periodic Acid Schiff
Periodic Acid Schiff
RAS
Renin-Angiotensin-System
renin-angiotenzin rendszer
TRP%
Tubular Reabsorption of
tubularis foszfát reabszorpció
Phosphate UH
ultrahang
vvt
vörösvértest
9
2. BEVEZETÉS Sir John Thornycraft, angol hajóépítő - a Thornycroft hajóépítő társaság megalapítója - nevéhez fűződik az első torpedóromboló hajó kifejlesztése. 1894-ben az elsők között elkészült, H. M. S. Daring nevet viselő torpedóromboló, mind sebességében, mind hatóerejében elégtelennek bizonyult. A hiba okát keresve Sir John Thornycraft és társa, Sidney Barnaby, megfigyelték a hajócsavar propellerének erős rázkódását és csúszását működés közben. Miután négy rend propeller szárnyat kicseréltek, megtalálták a probléma megoldását. A propeller lapátok felszínének növelésével és a szögsebesség csökkentésével gyorsabb, megbízhatóbb torpedót hoztak létre. Sir John Thornycraft és Sidney Barnaby megfigyelése, miszerint a mozgó propeller buborékok létrejöttéhez vezet, volt az első leírása, annak a jelenségnek, amit ma kavitációnak nevezünk. Buborékok létrejönnek mind turbulens áramlás esetén, mind pedig, folyadékok ultrahangos besugárzása esetén. A második észrevételük szerint a propelleren keletkező buborékok miatt a propeller felszínén eróziók jöttek létre. Ennek a felismerésnek a magyarázatát kívánta tisztázni az a munkacsoport, amelyet 1915-ben az Angol Haditengerészet állított fel. 1917-ben az angol százmazású Nobeldijjas fizikus, Lord Rayleigh, is csatlakozott a kutatáshoz. Ő írta le az első matematikai modellt, amely a buborékok összenyomhatatlan folyadékokban való összeesését próbálta megjósolni. A modell szerint a buborékok összeesésekor roppant nagy helyi hőmérséklet (10 000 K) és nyomás (10 000 atm) emelkedés jön létre. Tíz évvel később, 1927-ben, Robert W. Wood, amerikai fizikus, és Alfred Lee Loomis, amerikai fizikus, írta le először az ultrahang kémiai és biológiai hatásait. Ezen mérföldkövek letételével elkezdődött az a napjainkig tartó kutatás, amely az ultrahang terápiában és képalkotásban való egyre szélesebb körű felhasználását szolgálja (1).
10
2.1 Az ultrahang és a folyadék kölcsönhatása Az ultrahang és a folyadékok kapcsolatának hagyományos leírása szerint három fő mechanizmus szerint csoportosíthatjuk az interakciókat: hőmérséklet emelkedéshez köthető, kavitációs hatáshoz köthető és sem nem hőmérséklet emelkedéshez, sem nem kavitációs hatáshoz nem köthető, egyéb mechanikai hatások (1. ábra) (1-2).
1. ábra: Az ultrahang hatásai az akusztikus nyomásamplitudó függvényében. Vázlatos diagramm, amely bemutatja, hogyan változik a tapasztalt hő ( ), kavitációs ( ) és nem hő-, nem kavitációs (egyéb mechanikai) ( ) hatások jelentősége az akusztikus nyomás amplitudó változásával. Kis akusztikus amplitudó esetén a kavitációs és egyéb mechanikai hatások vannak túlsúlyban, míg a nagyobb akusztikus amplitudó tartományokban a hőhatások dominálnak és elfedik a jelenlévő kavitációs és egyéb mechanikai hatásokat (1). Amint az az ábráról is latható, az ultrahang által kiváltott, akusztikus kavitáció, illetve egyéb mechanikai hatások előfordulása függ a nyomás amplitudótól. Fontos jellemző a hőmérséklet emelkedéshez köthető hatások kiváltásában az adott térfogaton áthaladó energia flux, amely az esetek egy részében arányos a nyomással. Ezért
11
sokszor az ultrahang erőteret intenzitás helyett annak nyomásával jellemzik, ez látható az 1. ábra x tengelyén is. Alacsony akusztikus nyomás esetén a nem hőmérséklet emelkedéshez köthető biológiai hatások dominálnak. Amint az ultrahangos erőtér nyomása emelkedik, úgy jelenik meg először a kavitációs hatás, majd a hőmérséklet emelkedéshez köthető hatások, míg a nagy nyomású ultrahangos erőterekben a minden egyéb eredetű biológiai hatást elfednek a hőmérséklet emelkedés álta kiváltott hatások. 2.1.1 Hőmérséklet emelkedés Az ultrahang hullám által közvetített energia gyengül, amint a szöveten áthalad. Két fő mechanizmushoz köthető az ultrahangos energia elveszítése: az első az abszorpció, a második a szóródás (3). A szövet különböző területeinek különböző az akusztikus impedanciája, ami miatt az ultrahang kiterjedése változó, ezért az elsődleges ultrahang hullámon kívül eső területre szóródik az energia. Az energia egy része az elsődleges ultrahang sugáron belül helyileg abszorbeálódik (különböző mechanizmusok által, mint például a viszkózus nyíró hatás, illetve relaxációs folyamatok során) és ez vezet a helyi hőmérséklet emelkedéshez (4-6). Az aktuális hőmérséklet emelkedés becslése összetett tudást igényel, amelyben mind az akusztikus abszorpciós koefficiens, mind a szövet kondukciós és konvekciós tulajdonságainak ismerete szükséges (7). Fontos szerepe van a helyi véráramlásnak a végül elért hőmérséklet emelkedésben. A helyi véráramlás azonban függ az alap hőmérséklettől és a ultrahang behatási idejétől. Ezen tulajdonságok, számszerű pontos ismerete élő szervezetben nem mindig mérhető, ezért az ultrahang által kiváltott helyi, hőmérséklet emelkedéshez köthető terápiás alaklmazások bevezetése mindaddig váratott magára, míg sikerült megbízható módszert
kidolgozni,
a
kezelt
terület
hőtérképének
megrajzolására
(a
legmegbízhatóbban mágneses rezonancia képalkotás segítségével lehet a helyi hőmérsékletemelkedést megbecsülni, lásd: „Ultrahang terápiás alkalmazásai”). 2.1.2 Kavitáció Kavitáció alatt értjük az ultrahangos erőtérnek kitett közegen belül gázzal, vagy gőzzel töltött buborékok keletkezését és aktivitását. Kavitáció létrejön vízben, szerves oldószerben, biológiai folyadékban, folyékony héliumban, és olvasztott fémben, úgy, 12
mint még számos egyéb folyadékban (8). Általában két típusú buborék aktivitást különböztetünk meg, a stabil kavitációt és az átmeneti (vagy összeeső, inerciális) kavitációt. A stabil kavitáció során a buborékok oszcillálnak (a buborék sugarához képest kis amplitudójú oszcilláció) az ultrahangos erőtérben (9). A buborékok sugara az egyensúlyi érték körül mozog, a buborékok számos (akár több ezer) akusztikus cikluson keresztül jelen vannak. Akusztikus áramlás és jelentős nyíróerők (részletes tárgyalásuk az „Egyéb mechanikus hatások” alfejezetben talalható) gyakran kísérik a stabil kavitációt. Átmeneti, vagy összeeső kavitáció során a buborékok nem stabilis módon oszcillálnak, azaz a buborékok sugara nagyon különböző (az egyensúlyi értékhez képest), így oszcillálnak néhany akusztikus cikluson keresztül, majd hirtelen megnőnek, és végül szétrobbannak, és összeesnek(10-17). A folyamat, amelyben ultrahangos erőtérben a folyadékban oldott gáz átalakul buborékká, azaz „szabad gázzá”, az egyenirányított diffúzió (13, 18-21). Az akusztikus kavitáció kétféle módon hathat a közegre. Az egyik maga a buborék, hiszen a közeg egysége megbomlik az inhomogén buborék megjelenése által. A másik út, amivel a kavitáció befolyásolja a közeget, az a buborékok dinamikája (22). A buborékok belseje, illetve a buborékot közvetlenül körülvevő közeg állandó változáson megy keresztül. A buborék-folyadék érintkező felület alakja, mérete állandóan változik. A folyadék molekulák diffundálnak a buborék belsejébe, illetve hagyják el a buborékot; a környező folyadék gáz koncentrációja változó. Akusztikus áramlás jön létre (lásd „Egyéb mechanikai hatások alfejezet) a folyadékban, a buborék közelében, gyakran okozva ezzel jelentős shear stress-t (vagy nyíró erőt). A buborékon belüli nyomás és hőmérséklet gyorsan változik, a buborék oszcillációjának megfelelően sugárzik akusztikus energiát. A folyadék alacsonyabb hőmérséklete és viszkózusabb volta csillapítja a buborék oszcillációját. Ezen folyamatok mindegyike különbözőképpen nyilvánul meg, de mindegyik a folyadék megváltozásához vezet. Az akusztikus nyomás ritkulásához szükséges negatív nyomás, amely a buborékok keletkezését biztosítaná tiszta folyadékban, néhány 100 bar lenne. Azonban kavitáció létrejön általában egy adott folyadékban, mint például a vízben is, sokkal kisebb akusztikus nyomás esetén is (< 1 bar). Ennek magyarázata az, hogy a folyadékok többsége nem tiszta, hanem különböző mennyiségben tartalmaz szennyeződést, vagy más anyagot, amely a folyadék inhomogenitását eredményezi. Ezek aztán mintegy
13
csapdát képeznek, amelynek a felszínén buborékok keletkezhetnek sokkal alacsonyabb nyomáson. Több kutatás irányult az akusztikus kavitáció kiváltásához szükséges küszöbérték meghatározására (23-27). Nappiras például két küszöbértéket is leírt, egyet a stabil kavitáció előidézéséhez, és egy másikat az átmeneti kavitáció kiváltásához. A kavitáció kiváltásához szükséges küszöbérték kísérleti úton való meghatározása összetett feladat, hiszen az érték nagyszámú jellemző együttes befolyásoló hatásától függ. Ezek a paraméterek függnek: az akusztikus erőtér jellemzőitől, a besugárzott minta jellemzőitől, valamint a felhasznált a mérőmódszertől. A kavitációs küszöbérték változása az alábbiak szerint összegezhető. 1. A kavitációs aktivitás nő az akusztikus nyomás növelésével. 2. A kavitációs küszöbérték nő az ultrahang frekvencia növelésével. 3. A kavitációs küszöbérték nő, a környező nyomás növelésével. 4. A kavitációs küszöbérték nő a besugárzott folyadék viszkozitásának növelésével. 5. A kavitációs küszöbérték csökken a besugárzott folyadék gáz tartalmának növelésével. 6. A kavitációs küszöbérték csökken a besugárzott folyadék hőmérsékletének növelésével.
2.1.3 Egyéb mechanikai hatások A korábban említett jelenségek megértéséhez az akusztikus amplitudó lineáris változását, vagy az első nem lineáris változását használtuk fel (2). A következőkben leírt ultrahang-folyadék interakciók megértéséhez a lineáris elmélet nem megfelelő. Ezek a nagy nyomású hullámok, amint a közegen áthaladnak torzulnak, amely a harmonikus hullámok keletkezéséhez, végül pedig jelentősebb energia vesztéshez vezet. A nem lineáris hatások megváltoztathatják az akusztikus erőtér eloszlását és az energia lerakódást, amely felhasználható különböző biológiai hatások kiváltásánál (pl: membrán permeabilitás megváltoztatása), illetve a képalkotó ultrahang esetében a szöveti perfúzió meghatározása során (27-29).
14
2.1.3.1 Akusztikus áramlás Akusztikus áramlás alatt értjük, az ultrahang által kiváltott, “idő-független” áramlását a folyadéknak. Ennek a jelenségnek az eredete a folyadék lendületének megőrzésében keresendő, míg az ultrahang abszorpció és terjedés hatására a folyadék lendületének szétoszlása következik be (2). Számos ultrahang által kiváltott hatás köthető az akusztikus árámláshoz. Ilyen például a fokozott hőátadás, az emulzifikáció, a szonikációval kiváltott biológiai hatások, mint például a vér-agy gát átjárhatóságának növelése (lásd: “ Ultrahang terápiás alkalmazásai”). 2.1.3.2 Sugárzási erő, vagy sugárzási nyomás Bármely ultrahangos erőtérben lévő anyag egy erő hatásának van kitéve, amely erő nagysága és iránya függ az ultrahangos erőtér intenzitásától és az erőtér jellemzőitől, valamint az ultrahangos erőtérnek kitett anyag méretétől, alakjától, az anyag alkotóitól. Ezt a sugárzási erőt (radiation force, radiation pressure, radiációs erő, vagy nyomás), az irodalomban egyes helyeken sugárzási nyomásnak is nevezik. Egy ultrahagos erőtérben lévő ér esetében ez az erő, amely az ér falára hat. A 2. ábra összefoglalja az ultrahangos erőtérben lévő ér, apró gázzal telt buborék és a folyadék lehetséges kölcsönhatásait (30-32).
15
2. ábra: Gázzal töltött buborékok viselkedése ultrahangos erőtérben. Az ultrahangos erőtér és a gázzal telt buborékok kölcsönhatásának legagresszívabb formája az instabil, vagy inerciális kavitáció, amely az érfolytonosság megszakadását válthatja ki. Ettől eltérően az egyéb kölcsönhatások, mint a radiációs nyomás, vagy a buborékok oszcillációja és a buborékok körül keletkező akusztikus áramlás az érfal integritásának megtartása mellett eredményezi az érfal funkcionális változását.
2.2 Az ultrahangos erőtér kiváltása, az ultrahang és folyadék kapcsolatának vizsgálata 2.2.1 Az ultrahangos erőtér előállítása Az akusztikus erőtér előállításához számos megoldás létezik. Az első berendezések, amelyeket elsősorban kavitáció létrehozására készítettek, lapos trandszucert használtak az ultrahangos erőtér létrehozásához (33). Ezeknek a berendezéseknek egy jelentős hátránya van. A lapos transzducerek nagy amplitudójú akusztikus erőteret hoznak létre mind a transzducer közvetlen közelében, mind pedig attól távolabb a folyadékban. Ennélfogva, és mert a szilárd-folyadék felszín elsődleges helyet biztosít a buborékok létrejöttében, az első probálkozások azzal végződtek, hogy buborékok a transzducer felszínén képződtek. Így a kavitáció lényegében mind a transzducer anyagának, mind a folyadéknak része volt. A kavitáció létrehozása a transzduceren, vagy annak közvetlen közelében nem kívánatos. A kavitáció során hevesen összeeső buborékok a transzducer felszínén eróziókat hoznak létre (34). Ezenfelül, a buborékoknak az akusztikus impedanciája jelentősen eltér a folyadékétól, a 16
transzducer felszínén létrejövő buborékok impedancia különbséget hoznak létre a transzducer és a folyadék között, csökkentve ezzel az ultrahangot előállító eszköz hatékonyságát. Harmadszor a buborékok maguk jó abszorbensei az ultrahangnak. Ha buborékok keletkeznek a transzducer előtti területen, az ultrahang, amint ezen a területen áthalad, jelentős mértékben gyengül, a folyadék egészét érintő inszonifikáció jelentősen csökkent (ezt nevezzük a buborékok árnyékoló hatásának) (35). Ahhoz, hogy a transzducer felszínén keletkező buborékok előfordulása csökkenjen, a transzducer felszínén a nyomás amplitúdó minimális kell legyen. Ehhez társul még az az igény, hogy a folyadék belsejében a kavitáció kiváltásához szükséges nagy nyomású amplitudó jelen legyen. Ennek a két kitételnek tesz eleget, ha a transzducer fókuszált. A fókuszált transzducer általában konkáv, gömbszerűen fókuszált, piezoeletromos transzducer. A 3. ábra mutatja a fókuszált transzducer lehetséges formáit. Amint a fókuszált ultrahang frekvenciája a megahertz tartományból a 200-300 kHz tartományba csökken, úgy nő a fókusz nagysága, csökken a hőmérséklet emelkedéshez köthető hatás és az inerciális kavitáció előfordulása, helyettük uralkodóvá válik a stabil oszcilláció, és az akusztikus áramlás.
17
3. ábra: A fókuszált transzducerek. Az ultrahang sugár egy pontban való egyesítése többféle tranducer segítségével jöhet létre. A. Gömbölyű, B. Lencse, C. Reflektor és D. Elektromos fókuszálás. Az elektromos fókuszálás során sok (nem ritkán több száz elemből álló, úgynevezett ”phased array” segítségével egyidőben az egyes elemek külön irányításával a fókusz mérete növelhető, az összeadódó hőmérsékletemelkedés kivédhető és a kezelés időtartama csökkenthető. Forrás: Kullervo Hynynen (1996) Focused ultrasound surgery guided by MRI, Science and Medicine.
A fókuszált transzducer által létrehozott kavitációk és egyéb mechanikai hatások újabb előnye, a lapos transzducerrel szemben, hogy a kavitációk létrejöttének helye előre megjósolható, azaz a kavitációk kizárólag a fókuszon belül keletkeznek. Míg a
18
lapos transzducer által kiváltott uniform erőtérben a kavitáció folyadékon belüli keletkezése véletlenszerű, előre nem megjósolható. Ennek az előnynek az értéke a különbőző biológiai hatások kiváltásában nagyon jelentős, a kavitációk előidézése megjósolhatóvá és irányíthatóvá válik. 2.2.1.1 Az ultrahangos erőteret biztosító transzducer anyaga Az ultrahangos transzducerek anyaga általában piezoelektromos anyag. A piezoelektromos anyag, ha mechanikai stressznek van kitéve, elekromosan polarizálódik, és fordítva, ha elektromosan polarizálják, akkor megváltozik az alakja. Az alakváltozás mértéke a polarizálódás mértékétől függ. Amennyiben a polarizáció váltakozik, egyszer pozitív, egyszer negatív, akkor az alakváltozás is váltakozik, azaz az anyag vastagsága a polarizációs váltakozásának frekvenciájával váltakozik. Sok különböző anyagnak van piezoelektromos tulajdonsága, ilyenek lehetnek például kristályok, mint a kvarc, tourmaline, a Rochelle só és a bárium titanát; ezenkívül kerámia, mint az ólom cirkónium titanát (PZT); poláris polymer filmek, mint a polyvinyl klorid (PVC), vagy a polyvinyl flourid (PVF). A kerámia transzducerek igen elterjedtek az ultrahangos jel előállításában, mert előállításuk nem nagyon drága, és a legkülönbözőbb formában, alakban mintázhatók, és így nagyszámú kísérleti követelménynek tudnak eleget tenni (33-34). 2.2.2 A folyadék jellemzői A folyadék jellemzői, mint azt már a kavitáció kiváltásához szükséges küszöbérték meghatározásánál láttuk nagyon fontos paraméterek. Ebből adódóan ahhoz, hogy az ultrahang és a folyadék kölcsönhatását megbízhatóan megjósoljuk, illetve pontosan tudjuk, hogy mely kölcsönhatás típus fog bekövetkezni a lehető legtöbbet kell tudnunk a folyadékról. A folyadék, kísérlet időpontjában lévő jellemzőin túl, szükséges ismerni a folyadék történetét is. Ahhoz, hogy ezeket az információkat megszerezzük a folyadék egyes jellemzőit meg kell tudnunk változtatni. Ezáltal kidolgozhatunk egy módszert az egyes ultrahang-folyadék interakciók adott folyadékban bekövetkező megbecsülésére. Ezenkívül törekedni kell arra, hogy a már beállított folyadékot jellemző értékek a kísérlet során ne változzanak (36-39).
19
2.2.3 Az ultrahang és a folyadék kapcsolatának megfigyelése, követése A kavitáció küszöbértékének mérése nagyban függ attól, hogy milyen módszert választunk ehhez (40-45). Valójában az egész kiváltási küszöb elképzelés nagyban függ attól, hogy melyik az a jelenség, amit regisztrálni szeretnénk. Például, ha a szabadgyökök keletkezését tekintjük küszöbnek, akkor a küszöb jelentősen különböző és összefüggésben nem álló lehet az olyan küszöbértékkel, amely a pulzáló gázban lévő, egyenirányított diffúziót méri, mint kavitációs küszöbértéket (40). Úgyszintén, egy észlelő módszer, amely jól működik egy adott ultrahangos műveletben (pl.: folyamatos, alacsony frekvenciájú ultrahang), az nem biztos, hogy jól használható egy másik módban működő műveletben (pl.: pulzus módú, nagy frekvenciájú ultrahang). Azaz, mielőtt a kavitáció megfigyelési módjáról valaki döntene, szükséges tudnia, hogy milyen jelenségre számít, illetve azt, hogy a jelenséget milyen ultrahangos technikával váltják ki (41). Az alábbiakban egy rövid összefoglalás következik a lehetséges megfigyelési módokról. Talán a leggyakoribb küszöb kritérium volt a hallható „klikk”, amely az átmeneti kavitáció során, a buborékok hirtelen összeesésekor keletkező sokk hullámot kíséri. Ez a kritérium, bár hasznos a kiloherz tartományú, folyamatos hullámú ultrahang által kiváltott átmeneti kavitáció azonosításában, teljesen használhatatlan a megaherz tartományú, pulzus módú kavitáció azonosításában (45). Egy másik gyakran használt kritérium, az ultrahangnak kitett területen a szabad buborékok jelenlétének vizsgálata, ez azonban csak az egyirányított diffúzió által létrejövő buborékokat jelzi. Ilyen buborék „növekedés” azonban létrejöhet minden agresszív hatás (sokk hullám vagy szabadgyök keletkezése) nélkül is. Kavitációt ki lehet mutatni kémiai úton, különböző reakciók során is, amelyek gyakran szabadgyök keletkezéssel járnak. Ennek a módszernek az az előnye, hogy a teljes ultrahangos erőteret vizsgálja, és hogy nagyon érzékeny módszer. Hátránya viszont, hogy nem végezhető a kísérlettel egy időben, illetve a kimutatási módszer gyakran bonyolult. Egy újabb kimutatási módszer szerint az oszcilláló buborékoktól származó, az ultrahangos erőteret keltő frekvencia szubharmónikusainak észlelése. A buborékok csak akkor bocsátanak ki szubharmónikusokat, ha
20
hevesen oszcillálnak. Ebből
fakadóan, azokat a buborékokat, amelyek nem olyan hevesen oszcillálnak a műszer nem regisztrálja. Hasonlóan, ha valaki csak az átmeneti kavitációt (amelyben a buborék hirtelen összeesik) szeretné regisztrálni, akkor ez a módszer (számára) nem megfelelő. A szubharmónikusok kimutatása azt mutatja meg, hogy a buborékok hevesen oszcillálnak, de ez nem szükségszerűen átmeneti kavitáció, hanem inkább olyan stabil kavitáció, amelyben a buborékok a sugarukhoz képest, relatív nagy amplitudóval oszcillálnak számos ciklus során. Észlelni lehet a kavitációt hirtelen ultrahang abszorpción keresztül is. A kavitációs küszöb a referencia akusztikus pulzus, amely a folyadékon áthalad (függetlenül a kavitációt kiváltó erőtértől), jelentős abszorpciója által meghatározott. Az abszorpció kezdete jelzi a folyadékban lévő buborékokat. Ez a módszer azonban nem képes a stabil és az átmeneti kavitáció elkülönítésére. Azonban ennek a módszernek a segítségével a buborékok mérete meghatározható. Adott frekvencián az ultrahang elnyelés függ a buborék sugarától. Ennélfogva, különböző hullámsávú frekvenciák használata esetén meghatározható, mely frekvenciaalkotó gyengül leginkább, és ebből következtetni lehet a képződő buborékok méretére. A buborékok kimutathatóak optikai úton is. Folyadékban lévő buborékok szemmel is láthatóak (21). Ennek ellenére, a szem, mint detektor nem megfelelő, hiszen a buborékok mérete kicsi, illetve élettartamuk, például átmeneti kavitáció esetén, igen rövid. Fényképészeti módszerek segítségével sikerült kavitációt megmutatni, de maga a fényképészeti folyamat miatt ez egy késleltetett módszer, amely inkább a kavitáció „elkapásában”, mint annak kiváltásának körülményeinek tisztázásában segíthet. A buborékok felszínén a fény szóródik, ezt szintén ki lehet mutatni, azonban ez a módszer a szórt fény alkotóinak pontos csoportosítását igényli, és a kavitáció kiváltási iránya a fénysugár irányában kell, hogy legyen (33). Általánosságban elmondható, hogy sokféle módon lehet a különböző kavitációs típusokat kimutatni. A módszer kiválasztása azon alapszik, hogy mely típusú kavitációt szükséges kimutatni, illetve, hogy a választott kavitációt meghatározó módszernek mik a korlátjai.
21
2.3 Mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyagok Az eddigiekben leírt folyadék és ultrahang kapcsolatát jellemző kölcsönhatások felhasználták azt, hogy az ultrahang hatására a folyadékban gázzal, vagy gőzzel telt buborékok képződnek (18). Néhány évvel ezelőtt Hynynen és munkacsoportja, azt vizsgálta, hogy ha a gázzal telt mikrobuborékokat a fókuszált ultrahangnak kitett folyadékba juttatják (sejt szuszpenzió esetében a tápoldatba, állatkísérletek során a véráramba jutatták), akkor az ultrahang biológiai hatásai jobban kiszámíthatóak-e, és ezáltal, jobban irányíthatóak-e. Feltételezésük szerint az ultrahang érfalra, illetve sejtmembránra kifejtett hatását a buborékok közvetítik, valamint a buborékok egyfajta energia koncentrátorok, így az általuk kiváltott hatás ott jön létre, ahol a buborékok vannak. Ehhez járult még, hogy mivel a buborékokat a folyadékhoz adjuk és nem az ultrahang hatására keletkeznek, kisebb energiájú/frekvenciájú ultrahang is előidézi a buborékok viselkedésének megváltoztatását, azaz kisebb (~200-300 kHz) frekvencia tartományú fókuszált ultrahang is képes a kavitáció vagy egyéb mechanikai hatás kiváltására. Ezáltal elkerülhető a nemkívánatos hőmérsékletemelkedés és az előre megjósolhatatlan átmeneti kavitáció keletkezésének az esélye csökkenthető.
Az
eddigi vizsgálatok ezt a feltételezést megerősítették. A felhasznált mikrobuborékok szabvány szerint gyártott, klinikailag felhasználásra bevezetett,
kereskedelmi
forgalomban
lévő,
diagnosztikus
ultraszonográfiás
kontrasztanyagok. Ilyen például az Optison™ (GE Healthcare, Milwaukee, WI). Ennek a mikrobuboréknak két alkotója van, a belső, egy gáz, perfluorocarbon (perflutrén), illetve egy héj, amely human albuminból van. Egy másik hasonló ultraszonográfiás anyag a Definity® (Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA). Ennek gáz alkotója szintén perflutrén, míg a héj, albumin helyett, lipid tartalmú. A mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag átlagos mérete 1,54,5 µm között változik, úgy, hogy a maximális buborék átmérő 20-30 µm. Ez a mérettartomány lehetővé tesz, hogy az intravénásan beadott mikrobuborékok eljussanak a kapillárisokig. Néhány mikrobuborék, amely túl nagy, ahhoz, hogy a kapillárisokig eljusson, a tüdőn keresztül elhagyja a szervezetet (46-49). Az 5. ábra szemlélteti a mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag szerkezetét.
22
4. ábra: A mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag szerkezete. A mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag külső héját albumin, vagy lipid réteg képezi, míg belső része gáz, az általunk használt kontrasztanyag esetében ez perflutrén volt.
2.4 A fókuszált ultrahang terápiás felhasználásai 2.4.1 Történeti kitekintés Régóta ismert, hogy a FUS segítségével, élő szövetben, egy adott fókuszpontban hőmérsékletemelkedés, illetve más mechanikai hatások eredményeként, változás idézhető elő (3). Az első kísérleteket, melyben a FUS-t, mint terápiás eszközt próbálták használni 1942-ben végezte John G. Lynn, aki máj daganatos elváltozását próbálta kezelni fókuszált ultrahanggal. Azóta számos kutatás irányult a FUS által kiváltott biológiai hatások megismerésére, illetve a lehetséges felhasználási területek kipróbálására. Mindenekelőtt a Fry testvérek munkája érdemel különös figyelmet, akik az 1950-es években kifejlesztettek klinikai használatra egy FUS eszközt, amely hyperkinetikus betegségekben, mint például a Parkinson kór, szenvedő betegeket volt hivatott kezelni (33). Az 1980-as években Lizzi és munkacsoportja fejlesztette ki az első FUS berendezést, amelyet az Egyesült Államokban betegek kezelésére engedélyeztek (32-33). Ennek a berendezésnek a segítségével több, mint 1 000 glaukómában szenvedő beteget sikeresen kezeltek. A későbbiekben viszont a lézeres kezelés átvette a FUS szerepét ezen a területen. A FUS klinikai alkalmazásai, amelyek kipróbálás alatt vannak (emlő, prosztata jó-, és rosszindulatú elváltozásainak a kezelése), vagy már bevezetettek (uterus jóindulatú elválozása – fibróma FUS kezelése) a klinikai gyakorlatba, leginkább a tumor ellenes kezelések közé tartoznak. A kezelés alapja a FUS által kiváltott hirtelen 23
hőmérsékletemelkedés. állatkísérletes
A FUS felhasználás további fejlesztései, amelyek még
fázisban
vannak,
a
sejt,
illtve
vaszkuláris
permeabilitás
megváltoztatását tűzik ki célul és a FUS által kiváltott kavitációs és mechanikai hatások kiváltásához kötődek (46-49). 2.4.2
A
fókuszált
ultrahang
hőmérsékletemelkedéshez
köthető
terápiás
felhasználásai Termálabláció alatt értjük a hőmérséklet változtatás által kiváltott szövetpusztítást/eltávolítást. A gyakoratban ez azt jelenti, hogy valamilyen eszközzel hőmérséklet emelkedést (>55 °C), vagy hőmérséklet csökkenést (< -20-50 °C) hozzanak létre a kezelni kívánt területen (52). Képalkotó eszközök segítségével a kezelni kívánt terület kijelölhető, a helyi hőmérséklet emelkedés követhető, a kezelt terület energia elnyelése ellenőrizhető, valamint a szövet kezelésre adott válasz reakciója felbecsülhető (7, 54).
Erre a célra a legmegfelelőbb módszer az MRI
vezérelt beavatkozás. Ez a módszer a kezelés követése mellett (mind szerkezeti feldolgozás, mind hőtérkép készítésének segítségével) a kezelés irányítását (az adott szerv, kezelést megelőzően eltervezett helyére kerüljenek a szonikációk, illetve a kiváltott hőmérsékletemelkedés is az előre meghatározott szövettérfogaton belül következzen be)
is lehetővé teszi, amely egyetlen más képalkotó rendszer
segítségével nem oldható meg. A hőmérsékletemelkedés okozta szöveti károsodás mértéke függ a kezelés álta elért hőmérséklettől, és a behatási időtől, azokkal nem lineáris kapcsolatban változik (51). Irreverzibilis szöveti károsodás kiváltásához a szövetek néhány másodpercre 60 °C fölé melegítése megfelelő (56). A hőmérsékletemelkedés hatására a kis erekben lévő vér alvadása kiváltható, illetve a véráramlás az adott szövetben megállítható (7). Nagyobb erek elzárása is lehetséges ultrahang segítségével (7), amely nem invazív kezelési alternatívát jelenthet testen belüli vérzés kezelése esetén. Mikor a szöveti hőmérséklet eléri a 100 °C-ot, a szövetben lévő víz forrni kezd, és a gáz képződés miatt az ultrahang hullám terjedése megszakad, ami a szövet energia elnyelését jelentősen megváltoztaja (46). A FUS által célzottan, a környező ép szöveteket nem érintve, a célterület rövid időre 60 °C fölé melegítését, különböző jó-, és rosszindulatú elváltozások kezelésére
24
használják, ilyenek például: az emlő, a máj, a prosztata, a csont, a méh és az agy tumorai (50-51). Az első táblázat tartalmazza FUS onkológiai területeit, valamint azok gyógyításban való státuszát. 2.4.3 A fókuszált ultrahang kavitációhoz és egyéb, mechanikai hatáshoz kötehető terápiás felhasználása A stabil kavitációnak, valamint az ultrahang és szövet egyéb mechanikai kölcsönhatásának, mint például a sugárzási erő, szintén vannak terápiás felhasználási lehetőségei (57-80). A FUS és mikrobuborékos ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes adásának hatására az agyi vaszkuláris permeabilitás, előre meghatározott helyen növelhető. Ezáltal az agy adott részébe olyan anyagok (például kemoterápiás gyógyszerek) juttathatók el, amelyek átlépését a vér-agy gát megakadályozná, lehetővé téve ezzel, például agytumorok, helyi, nem invazív úton való kezelését (68-80). A mikorbuborékok méretüknél fogva (1,5-4,5 µm) eljutnak az agyi kapillárisokba, majd a szövet FUS fókuszába lépnek, ekkor az ultrahang hullám terjedése által okozott, ciklusos akusztikus nyomás csökkenés és növekedés miatt, tágulnak és összehúzódnak. A mikrobuborékok oszcillációja a környező folyadék áramlását váltja ki, ezáltal a mikrobuborékok körül jelentős nyíróerők keletkeznek (71). Ezenfelül a sugárzási erő hatására mikrobuborékok az ultrahang terjedési irányába mozognak (71, 75, 78). A kavitációs küszöbérték felett a mikrobuborékok oszcillációja olyan nagy lesz, hogy a környező folyadék tehetetlensége a mikrobuborék összeesését váltja ki. Ezzel jelentős helyi hőmérséklet- és nyomásemelkedés jön létre, illetve sokk hullámok keletkeznek, amelyek igen nagy sebességgel, sugárirányban távolodnak a mikrobuborék összeesési helyétől (2. ábra) (23). Ha
a mikrobuborékok az érfal
közelében esnek össze, akkor az összeesés hatására folyadék jet-ek keletkeznek, amelyek az endotél sejtek folytonosságát megszakítva az érfalat kilyukaszthatják (23). Mivel a mikrobuborékok abszorbeálják és koncentrálják az ultrahang hullám energiáját egy mikroszkópikus méretű szövet részbe, ezáltal legalább két nagyságrenddel
csökkentik
a
biológiai
hatások
kiváltásához
szükséges
mikrobuborékok nélkül alkalmazott ultrahang energiát (68). A mikrobuborékok által kibocsátott akusztikus szignálok és a vér-agy gát permeabilitás növekedés kapcsolatát
25
részletesen vizsgálták (69). A vizsgálatok szerint a mikrobuborékok összeesését széleshullámsávú emisszió kísérte. A szövettani vizsgálatok szerint a mikrobuborékok által kiváltott átmeneti kavitáció a vörösvérsejtek érpályából való kilépését vonta maga után. Azonban, a mikrobuborékok stabil oszcillációja, amely szintén detektálható volt a kibocsátott akusztikus szignálokból, a vér-agy gát permeabilitás fokozódásával járt, úgy, hogy azt nem kísérte a vörösvérsejtek érpályából való kilépése (69-73). (1. táblázat).
26
1. táblázat. A fókuszált ultrahang terápiás felhasználása. Az ultrahang sugár egy pontban való fókuszálásával a szövetek helyi (a fókuszon belüli), rövid időtartamú (néhány másodperc), > 55 ºC hőmérséklet emelkedése idézhető elő, melyet, különböző szervek, jó-, és rosszindulatú elváltozásainak elpusztítására használnak fel. Az alábbi táblázatban a célszerveket, a kezeléshez szükséges képalkotó berendezést és a kezelés klinikai fegyvertárba való bevezetésének státuszát foglaljuk össze. Kezelt szerv
Alkalmazott
Klinikai státusz
képalkotó rendszer Uterus
MRI
FDA engedélyezte az USA-ban
Emlő
UH
Klinikai kipróbálási fázis Kínában
Emlő
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
Prosztata
UH
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban Kezelésként engedélyezett Európában, Kanadában és Kínában
Prosztata
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
Agy
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
Agytumorok
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
Csont
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
Máj
UH
Klinikai kipróbálási fázis Kínában
Máj
MRI
Klinikai kipróbálási fázis USA-ban
kemoterápiás kezelése
27
2.5 A glomeruláris permeabilitás alapjai A glomerulus a vese filtrációs egysége, egy igen kifinomult ultrafiltrációs berendezés, amely nagymennyiségű plazma filtrációját képes biztosítani, miközben a fehérjéket hatékonyan a keringésben tartja vissza. Az 5. ábra mutatja a glomerulus szerkezetét. Számos kutatócsoport vizsgálta (81-111) különböző módszerek segítségével (mikropunkciós technika, izolált glomerulus, két-foton mikroszkóp, stb) a glomeruláris barrier tulajdonságait az elmúlt 40 évben. A glomeruláris barrier képezi a határt a vér és az elsődleges vizelet, vagy filtrátum között. Három fő részből áll: első, a vér felé néző endotheliális réteg, második a glomeruláris bazálmembrán (GBM), végül a viszcerális epithel réteg következik (másnéven podocyta réteg), amely a filtrátum felé néz, és a podocyta lábnyúlványok segítségével a GBM felszínéhez tapad. A podocyta lábnyúlványok között helyezkednek el a filtrációs rések, amelyek között a filtrációs membránok képeznek hidat. Általánossan elfogadott, hogy a glomeruláris filtráció extracelluláris úton halad: át az endothel sejtek közötti „ablakokon”, majd a GBM-on, végül a podocyta réseken. Drummond és Deen (81, 85) a glomeruláris filtráció leírására egy olyan modellt hozott létre, amelyben a glomeruláris kapilláris fal sok ismétlődő egységből áll. Az általunk használt, alap strukturális egység a 6. ábrán látható.
28
5. ábra: A glomeruláris filtrációs rendszer. (Forrás: Tryggvason és munkatársai (136). Hereditary Proteinuria Syndromes and Mechanisms of Proteinuria. N Engl J Med 2006;354:1384-401. Kidney=vese, Renal cortex=vese kéreg, Renal medulla=vese velő, Bowman’s capsule=Bowman kaszula, Afferent arteriole=afferens arteriola, Distal tubule=distális tubulus, Efferent arteriole=efferens arteriola, Glomerular tuft= glomerulus boholy, Fenestrated endothelial cell=fenesztrált endotélium, Besement membrane=bazálmembrán, Podocyte=podocita, Slit diaphragm=slit diafragma, Filtration barrier=filtrációs barrier, Podocyte foot process=podocyta lábnyúlvány, Glomerular basement membrane=glomeruláris bazálmembrán).
29
2.5.1 A glomeruláris barrier részei 2.5.1.1 Epitheliáis vagy podocyta réteg
6. ábra: A glomeruláris kapilláris fal, idealizált, egy filtrációs slitnek megfelelő szerkezeti egysége. GBM= glomeruláris bazál membrán, L= a GBM vastagsága, W= a strukturális egység szélessége, w= a filtrációs slit szélessége. (81)
A podocyta réteg filtráció szempontjából legfontosabb nanostrukúrális méreteik azok, amelyek a podocyta résmembrán nyílásait képezik. A 7.A ábra mutatja a podocyta résmembránt, a 6. ábrán látható iránnyal megegyező elhelyezkedésben.
A
leggyakrabban idézett podocyta résmembrán elhelyezkedés az, amit Rodewald és Karnovsky (81) írt le. Ezt az elrendezést nevezik „cipzár” szerkezetnek, melyben a podocyta membránnal párhuzamosan egy középső filamentum helyezkedik el. A középső filamentumot váltakozva egyik, majd másik oldalhoz kapcsolják az úgynevezett „híd” rostok által (7.B ábra). Egy másik, egyszerűbb podocyta résmembrán elhelyezkedés, amelyet Hora és munkatársai írtak le, szerint a filamentumok úgynevezett „létra” elrendeződést követnek (7.C ábra). Ezeknek a 30
különböző szerkezeti elrendeződéseknek a később tárgyalásra kerülő glomeruláris barrier méretszelektivitásában van jelentősége, amint az az ábráról is látható, a „cipzár” szerkezet, jelentősebb méret szelektivitású, mint a „létra” szerkezet.
7. A filtrációs rések szerkezete. A. Az epitéliális slit diafragma áramlás irányára merőleges ábrázolása. B. Az epitéliális slit diafragma áramlás irányával párhuzamos ábrázolása, zipzár szerkezet. C. Az epitéliális slit diafragma áramlás irányával párhuzamos ábrázolása, létra szerkezet.
Az utóbbi évek kutatásai, amelyek a podocyta résmembrán szerkezet megértésére törekedtek, főként a nemrég azonosított, a podocyta résmembrán felépítésében résztvevő fehérjére, a nephrinre, összpontosítottak. A nephrin egy ~150 kDa molekula tömegű fehérje, amely kizárólag a podocyta résmembrán területén expresszálódik. A nephrin gén elégtelen expressziója kapcsolatban áll a Finn típusú, veleszületett nephrosis szindróma kialakulásával, amint azt Tryggvason és munkatársai (102) kimutatták. Ebben a betegségben a súlyos proteinúria normál GBM-el és a podocyta lábnyúlványok, résmembránok eltűnésével jár. Elképzelhető, hogy a szomszédos podocytákból származó nephrin molekulák egymással kapcsolatba lépve alkotják a „cipzár” szerkezetet (81, 112-125).
31
2.5.1.2 Glomeruláris bazálmembrán A GBM egy gélszerű, sejtet nem tartalmazó réteg, amelynek 90-93%-a víz (126-127). A GBM szerkezete egy IV-es típusú kollagén, laminin, fibronektin és heparán-szulfát proteoglikán alkotta hálózatból áll (100, 128). A IV-es típusú kollagén egy hármas helikális szerkezetű polipeptid, amely a GBM-en belül egy rostos hálózatot alkot, és ehhez egyéb mátrix alkotók kapcsolódnak. A laminin egy aszimmetrikus 4 ágú szerkezet, amelyet fontosnak tartanak a GBM stabilizálásában, illetve, a glomeruláris kapilláris fal sejt rétegei és a GBM közötti kapcsolat erősítésében. A szulfatált glikoprotein, entactin, vagy nidogén, kötődik a IV-es típusú kollagénhez, a heparánszulfát proteoglikánhoz és a lamininhoz. Ennélfogva fontos szerepet játszik a GBM alkotóinak egymáshoz kapcsolásában. Hasonlóan ehhez, a fibronektin (egy 500 kDa molekulasúlyú glikoprotein) kötődik a lamininhoz, a kollagén IV-hez és a heparánszulfát proteoglikánhoz, utalva arra, hogy a fibronektinnek is lehet szerepe a GBM alkotók összekapcsolásában. A heparánszulfát proteoglikán a GBM szárazanyag tartalmának ~1%-át alkotja (129). A GBM-ben túlsúlyban lévő proteoglikán, egy 400 kDa molekulasúlyú belső fehérjéből, a perlekánból és annak egyik végéhez kapcsolódó négy vagy öt heparánszulfát láncból áll (130). Az anionos heparánszulfát láncok pedig glukózamin és glukuronic acid alkotta diszacharid egységekből felépülő láncot alkotnak (131-134). 2.5.1.3 Endothel réteg Az endothel sejtek a GBM felszínén laza szerkezetet alkotnak (fenestrált endotélsejt réteg), az endothel sejtek között számos rés talalható, amelyek mérete: 70-100 nm között van (135). Az endothel sejetek között lévő, úgynevezett fenestrákban nincsen látható
membrán,
amely
fizikai
határt
képezhetne
a
plazmában
lévő
makromolekulákkal szemben (136). Az endothel sejtek lumináris felszínét borítja a glycocalyx, amely az endothel sejtek közötti réseket is kitölti. A glycocalyx réteg elsősorban
szulfatált
proteoglikánt
és
glikoproteint
tartalmaz
(81,
137).
Elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták, hogy 300 nm vastag filamentózus szerkezetű réteg talalható mind az endothel sejtek lumináris felszínén, mind pedig a közöttük lévő résekben („ablak” = fenestra) (138). Az endothel réteg luminális
32
felszínén elhelyezkedő negatív töltéssel rendelkező glycocalyxnak, hasonlóan a GBM-et alkotó, szintén negatív töltéssel bíró heteropolymetrikus hálózatnak a fehérjék keringésen belüli visszatartásában lehet szerepe, amelyre később, a glomeruláris barrier töltésszelektivitásának ismertetésénél még visszatérünk. 2.6 A glomeruláris permeabilitás A víz és a makromolekulák filtrációjában szerepet játszó glomeruláris kapilláris rétegek a fentiek során kerültek ismertetésre. Az egyes glomeruláris barrier rétegek glomeruláris permeabilitásban belöltött szerepét 50 évre visszatekintő vita tárgyalja. Az elmúlt időszakban a rendelkezésre álló bizonyítékok értelmezése tükrében, az inga kilengett egyik, vagy másik réteg fontosságának irányában. Mióta, 1999-ben, a nephrint azonosították, mint podocyta résfehérjét, majd a veleszületett, Finn típusú nephrosisban szerepét igazolták (102-136), azóta az uralkodó vélemény szerint a podocyta lábnyúlványok közötti rések, illetve az azokat összekötő membránon lévő rések szerepe a legfontosabb, mind a negatív töltésű albumin, mind a macromolekulak keringésen belüli visszatartásában. (131, 139-141). A korábbi vélemény szerint a GBM és az endothel réteg negatív töltésének, illetve a GBM szerkezetének van a fontosabb szerepe a glomeruláris permeabilitás méret és töltés szelektivitásában 106, 129, 132). Újabb kutató munka irányult arra, hogy miért nem dugulnak el a glomerulusok, ha egyszer bizonyos anyagokat az egyes szűrő rétegek fenntartanak, míg a korábbiak átengedik (142). A számos elképzelés közül az alábbiakban ismertetünk egy matematikai modellt, amely a víz filtrációjában betöltött, egyes glomeruláris barrier rétegek szerepét írja le. Ezt használjuk később a glomeruláris betegségek kapcsán megváltozott filtrációs viszonyok értékelésére is.
33
2.6.1 A víz filtrációjának glomeruláris szerkezeten alapú modellje A 6. ábrán látható glomeruláris kapilláris szerkezeti egységét Drummond és Deen, egy hidrodinamikus modell kidolgozására használta, amely a glomeruláris kapillárion keresztül zajló víz filtrációt írja le (81). A modell célja az volt, hogy a glomeruláris kapilláris effektív hidraulikus permeabilitását (k) megbecsülje. A glomeruláris kapilláris fal három rétege, az áramlással szemben, egy ellenállás sorozatot alkot, amelyben a teljes hidraulikus permeabilitás az alábbiak szerint adódik össze: 1/k = 1/ken + 1/kGBM + 1/kep
(1)
ahol ken, kGBM, és kep az endothel, a GBM és az epithel (vagy podocyta) réteg önálló hidraulikus permeabilitása. Ennek segítségével az effektív hidraulikus permeabilitás megbecsülhető a különálló rétegek permeabilitásának vizsgálatából, majd ezek összegzéséből az 1. egyenlet szerint. Elsőként a sejtrétegek permeabilitásának ismertetésére kerül sor, majd ezt követően a GBM-ére. Drummond és Deen a Stokes féle egyenlet felhasználásával jellemezte a podocyta rések közötti áramlást. Eredményeik szerint a podocyta lábnyúlványok között lévő résmembrán jelentős ellenállást képez a víz áramlásának útjában (85). Nem találtak áramlást akadályozó különbséget a 8. ábrán látható “cipzár”, vagy “létra” elhelyezkedésű résmembrán között. Ugyanezen Stokes féle egyenletet használták az endotheliális sejtek víz áramlással szembeni ellenállásának megbecsülésére is. Itt azonban jelentős különbséget találtak, ha az endothel sejtek közötti réseket szabadnak, vízzel töltve tekintették, vagy, ha az endothel sejetek közötti réseket, a korábban említett glycocalyx-szal kitöltöttnek vették. Azaz, míg a csupasz endothel réteg a víz irányában alig mutatott ellenállást (~2%), addig, ha a glycocalyx-ot figyelembe vették, akkor ez az érték jelentősen megnőtt (~24%). A GBM vízzel szembeni ellenállását megbecsülték csupasz GBM esetében és akkor is, ha számításba vették, hogy a GBM felszínét mindkét oldalon sejtes réteg borítja, és ezért annak, csak egy része elérhető a filtráció számára. Az in vivo GBM ellenállása a csupasz GBM-hez képest megközelítőleg 2,3-szoros (81-82). Eredményeikből arra jutottak, hogy a filtrációs rések távolságában, az endothelium sejtek fenesztrációinak nagyságában, illetve a fenesztrációk számában bekövetkező 34
csökkenés, a víz áramlásával szembeni ellenállás növekedésével jár. Az egyes rétegek pontos szerepének bizonytalansága ellenére elmondható, hogy a sejtrétegek és a GBM megközelítőleg azonos arányban osztozik a filtrációs ellenállás biztosításában. 2.6.2 A glomeruláris filtráció meghatározó tényezői A glomeruláris filtráció szabályozása a fizikai alapelveket illetően egyszerű, de a számos szabályozási út miatt funkcionálisan igen bonyolult. A filtrációs ráta (GFR), mint ahogyan a test egyéb kapillárisainak esetében, a glomerulusban is a kapilláris hydraulikus permeabilitás (k), a kapilláris filtrációs felülete (s) és a nettó filtrációs nyomás (NFP) áltál határozható meg. GFR = k x s x NFP Miután a glomeruláris kapilláris filtrációs felszínének kalkulálása nehéz, ezért egy, úgynevezett filtrációs koefficiens (Kf) bevezetését szokták használni, amely a kapilláris hydraulikus permeabilitás és a filtrációs felszín szorzata. Mint ilyen természetesen nem állandó, hanem a pillanatnyi körülményeknek megfelően, dinamikusan változó paraméter (befolyásoló tényezők a podocyta rés távolság változása a glomeruláris membrán permeabilitás változása) (100). A nettó filtrációs nyomás a számtani összege a kapilláris két oldalán jelentkező hidrosztatikus és onkotikus nyomásnak. Ezeket, Ernes Straling után, aki 1896-ban jellemezte így először a glomeruláris filtrációt, Starling erőknek is nevezik. NFP = (PGC – πGC) – (PBC – πBC) Ahol PGC a kapilláris hidrosztatikai nyomás, πGC a kapilláris plazma onkotikus nyomás, PBC a Bowman kapszula hidrosztatikusz nyomás, πBC a Bowman kapszulában lévő glomeruláris filtrátum onkotikus nyomása. Mikropunkciós kutatások szerint a Bowman kapszulában nagyon kevés fehérje található (106) (lásd még később: A glomeruláris filtráció töltésszelektivitása című alfejezetben), ezért πBC nullának vehető. A fenntiek értelmében: GFR = Kf (PGC – πGC – PBC)
35
A hidrosztatikai nyomás alig változik a glomeruláris kapilláris mentén, ennek oka az, hogy a nagy keresztmetszetű glomerulus teljes egésze csak kicsiny rezisztenciát jelent a plazmaáramlás felé. Azonban az onkotikus nyomás a kapilláris mentén jelentősen változik, hiszen a víz a vaszkuláris térből kilép, hátrahagyva a fehérjét. Ezáltal a nem filtrált plazma fehérje koncentrációja valamint onkotikus nyomása nő. Főként a kapilláris onkotikus nyomás növekedése miatt a nettó filtrációs nyomás csökken a glomeruláris kapilláris elejétől a vége felé haladva. Amint azt láttuk a GFR nem állandó érték, mind élettani, mind pathológiás folyamatok alkalmával változhat. Elvileg, ha „minden egyéb tényező állandó”, akkor bármilyen változás a Kf, PGC, πGC, PBC-ben változást hozhat létre a GFR-ben. 2.6.3 A glomeruláris filtráció szabályozása A szervezet só és vízháztartásának fenntartása szempontjából nagyon fontos a GFR megfelelő értéken tartása (143-152). A tubuloglomeruláris szabályozáson keresztül a vese autoregulációja biztosítja, hogy egészséges körülmények között is jelentkező vérnyomás emelkedés, vagy csökkenés során a glomeruláris kapillárisok ne sérüljenek. A Bowmann kapszulában keletkező elsődleges filtrátum először a proximális tubulusba kerül, majd a leszálló vékony szegmentumban, ezt követően a felszálló vékony szegmentumban halad, majd folytatja útját a felszálló vastag szegmentumban. A feszálló vastag szegmentum belép az arteria afferens és az arteria efferens átlal alkotott villába, közvetlenül a Bomann kapszula mellett. A tubulushám ezen a helyen speciális sejtcsoportokat tartalmaz, amelyeket macula densának nevezünk (6. ábra). A macula densát alkotó sejtek képezik a tubuloglomeruláris szabályozás alapját. Egy adott nephronban a filtráció nő, vagy csökken, ennek megfelelően, a nátrium visszaszívódása a proximális tubulusban, illetve a Henle kacsban, szintén, nő, vagy csökken. Minél több nátrium filtrálódik, annál több nátrium marad a nephron lumenben, és annál több filtrált nátrium halad a vastag felszálló szárban a disztális tubulus felé. amely speciális sejtcsoportból áll a nephron falában, ahol a nephron az afferens és efferens artéria között halad. A macula densa sejtek érzékelik a lumenben lévő nátrium és klorid mennyiségét, tulajdonképpen sódetektorként működnek. A nátrium klorid lumen koncentrációjában bekövetkező változás egyik hatása, hogy 36
változik az intersticiális térbe kiválasztódó transzmitter szekréció. Ezáltal pedig változik a filtráció a közeli glomerulusba. A macula densa mellett elhaladó emelkedett nátrium koncentrációjú áramlás csökkenti a filtrációs rátát, míg fordítva, a csökkent nátrium koncentrációjú filtrátum áramlás növeli a filtrációs rátát. A só érzékeny macula densából felszabaduló transzmitterek az afferens arteriola vasoconstrictióját idézik elő, ezzel csökkentve a glomeruláris kapilláris hidrosztatikai nyomását. Továbbá ezek a transzmitterek a glomeruláris mezangiális sejtek kontrakcióját is előidézik, ezáltal csökkentik az effektív filtrációs koefficienst. Mind a két hatás csökkenti az egyes nephron GFR-t, illetve megfelelő szinten tartja a többi nephronéhoz képest (143). A tubuloglomeruláris szabályozásban résztvevő hormonok és egyéb anyagok a következők: renin-angiotenzin rendszer (RAS), bradykinin, prosztaglandinok, nitrogén-monoxid. A GFR szabályozásában leírták a helyi RAS fontosságát. Ami szerint a RAS azon túl, hogy a vese helyi hemodinamikai viszonyait szabályozza, helyi szövet és/vagy sejt szabályozó. Számos hatása különböző, az utóbbi időben azonosított receptoron keresztül megy végbe (144) 2.6.4 A glomeruláris filtráció méretszelektivitása A glomeruláris kapilláris méretszelektivitásának meghatározására legtöbbször széles molekula méretben elérhető dextrán frakcionális clearance-ét használták. Ezekben a kísérletekben a Stokes-Einstein molekula sugár méretet használták, amely általában is elfogadott mérték a molekula méret leírásában. Miután nincs egyértelmű kapcsolat a molekula tömeg és az oldatban lévő polymer molekulák dimenziói között, ezért a Stokes-Einstein rádiusz megbízhatóbb összehasonlítási alapot szolgáltat a különböző tesztmolekulákból származó eredmények összehasonlítására, mint a molekulaméreten alapuló összehasonlítás. Ezenkívül, a Stokes-Einstein rádiusz használatának megvan az az előnye is, hogy jobban lehet felhasználni a glomeruláris barrier pórusainak leírásában (95-96, 153-156). A kis Stokes-Einstein sugarú, neutrális dextrán molekulák akadály nélkül filtrálódnak a glomeruláris barrieren keresztül, addig a ~40 Å Stokes-Einstein rádiuszú molekulák szinte nem jutnak át az elsődleges vizeleti térbe. Ez a Stokes-Einstein rádiusz
37
megközelítően megfelel a 70 000 Da molekulasúlyú dextrán méretnek. A töltéssel rendelkező molekulák filtrációja eltérő a töltéssel nem rendelkező, neutrális molekulákétól. Azaz a negatív töltéssel rendelkező molekulák kevésbé, illetve a pozitív töltéssel rendelkező molekulák nagyobb mértékben filtrálódnak, mint a méretben megfelelő, de töltéssel nem rendelkező molekulák (100). Hemodinamikai paraméterekben bekövetkező változások, mint például a glomeruláris plazma flow, vagy a transzmembrán hidrosztatikai nyomás különbség növekedése vagy csökkenése egyaránt befolyásolhatja a glomeruláris méretszelektivitást, anélkül, hogy a glomeruláris barrier alkotóinak fizikai jellemzői változnának (100, 130). 2.6.5 A glomeruláris filtráció töltésszelektivitása Az 1970-es és 80-as évek kutatómunkája alapján az a nézet alakult ki, hogy a glomeruláris barrier a méretszelektivitásán túlmenően töltésszelektivitással is rendelkezik. (99-100). Azaz a glomeruláris barrier egy, vagy több rétege negatív töltéssel rendelkezik, amely megakadályozza a negatív töltésű molekulák belépését és a barrieren való áthaladását, másfelől viszont segíti a pozitív töltéssel rendelkező molekulák glomeruláris barrieren való áthaladását. A töltésszelektivitást vizsgáló kísérletek többségében neutrális dextrán és anionos (dextrán szulfát) frakcionális clearance-t vizsgálták (99). Más kísérletekben natív (neutrális) és anionos tormaperoxidázt használtak. Az utóbbi néhány évben Comper és Deen egymástól független kutató csoportja (157160) megkérdőjelezte mind az említett tesztmolekulák megbízhatóságát, mind pedig a glomeruláris barrier töltésszelektivitását. Véleményük szerint legalább két tényező bonyolítja a dextrán szulfát frakcionális clearance-ből származó eredmények értelmezését. Először is, a dextrán szulfát plazmaproteinhez kötődik (160). Guasch és munkatársai
3
H-dextrán-szulfát és nem jelölt dextrán-szulfát ultrafiltrációját és
equilibrium dialízisét vizsgálta. Azt találták, hogy ~45%-a a 3H-dextrán-szulfátnak nem volt fehérjéhez kötött. A teljes radioaktivitás mérésének felhasználása a fehérjéhez kötött jelölőanyag mennyiségének meghatározására, a fehérjéhez nem kötött jelölőanyag mennyiségének túlbecsüléséhez, míg annak vizelet clearance-nek alábecsüléséhez vezet.
38
A másik probléma, amely felvetődött a dextrán-szulfát használatával kapcsolatban, az a proximális tubulus sejtek általi dextrán-szulfát felvétel és intracelluláris deszulfatáció, amint azt Comper és munkatársai számos kísérletben vizsgálta (110, 158, 162, 164-165). Összegezve,
az
elképzelés,
miszerint
a
glomeruláris
barriernek
van
töltésszelektivitása, amely részt vesz az albumin és az egyéb polyanionok glomeruláris filtrátumból való kizárásában továbbra is vita tárgyát képezi. Az biztos hogy a dextrán-szulfát nem annyira megbízható teszt molekula, mint azt a korábbi kutatásokból gondolták továbbá valószínűnek látszik, hogy a korábbi kísérletek eredményei túlbecsülték a töltésszelektivitás szerepét az albumin és egyéb polyanionok keringésen belül tartásában (81). 2.6.6 A podocyták válasz reakciója a mechanikus stresszre A glomeruláris kapillárist alkotó sejtek: endothel sejtek, podocyták és mezangiális sejtek a vérnyomás és a filtráció során keletkező folyadékáramlás következtében jelentős mechanikai hatásnak vannak kitéve (107). Feltehetően ez a hatás befolyásolja a glomeruláris sejtek struktúráját és funkcióját. A podocyták lábnyúlványaik segítségével borítják a glomeruláris bazálmembrán Bowman kapszula felöli felszínét. A podocyták citoszkeletonja egy rendezett egységet alkot, a lábnyúlványokban az összes, kontraktilitásban jelentős fehérje (aktin, miozin, α-aktinin, vinkulin, talin, stb) jelen van (166), a GBM felszínéhez az α3β1 integrin segítségével kapcsolódnak. Felmerült a lehetőség, hogy a podocyták esetleg a kapillárisfal nyomását ellensúlyoznák (107). Az is elképzelhető, hogy a podocyták alakjuk változtatásával hozzájárulnak a glomeruláris permeabilitás pillanatnyi szabályozásához, változtatva ezzel a pillanatnyi GFR-t is. In vitro körülmények között Endlich és munkacsoportja (122-124) azt találta, hogy a podocyták érzékenyek a mechanikai hatásokra. Erre a podocyták alakjában bekövetkező változásokból és az F-aktin szerveződésből tudtak következtetni. A glomeruláris permeabilitás pontos megértése, mind egészséges körülmények között mind pedig a glomeruláris betegségben még várat magára. A glomeruláris sejtek mechanikus hatásra való érzékenységének és válaszreakciójának in vivo vizsgálata elsődleges fontossággal bírhat a glomeruláris permeabilitás megértésében (8. ábra).
39
8. ábra: A glomerulus idealizált képe egészséges és epitél/podocyta réteg károsodás esetében. A vér bejut a glomeruláris kapillárisokba, majd filtrálódik a glomeruláris barrieren keresztül és a Bowman kapszulába jutva a filtrátum az elsődleges vizeletet képezi. Abban az esetben, ha a glomeruláris barrier Bowman kapszula felöli oldalán elhelyezkedő podocyta réteg károsodik, a podocyták elveszítik tartásukat, összecsúsznak, a filtrációs slitek száma csökken, a GBM podocytákkal borított felszíne nő, amelyet az albumin (fokozott) filtrációja és a glomeruláris filtráció csökkenése kísérhet (177). 40
2.7 A glomeruláris permszelektivitás vizsgálata dextrán, ficoll vagy globuláris fehérjék segítségével A glomeruláris permeabilitás, illetve a permszelektivitás vizsgálatához az 1970-es évektől használják a polidiszperz (széles mérettartományú) dextrán a keveréket, illetve a később bevezetett, ugyancsak széles mérettartományú keverékét a ficollnak. A poliszacharidok (mint a dextrán és a ficoll is) miután filtrálódnak a glomeruláris kapillárison,
a
fehérjéktől
eltérően,
a
proximális
tubulusok
által
nem
reabszorbeálódnak. Ebből adódóan a dextrán és a ficoll filtrációs koefficiense, azaz a filtrátum-plazma koncentráció hányadosuk, közvetlenül a vizelet clearance és a GFR meghatározásából kiszámítható. A polidiszperz dextrán vagy ficoll oldatok in vivo alkalmazása, valamint a vizelet és plazma
kromatográfiás
elemzése
tette
lehetővé,
hogy
egyidőben,
széles
mérettartományban lévő molekulák filtrációs koefficiensét meghatározzák. Míg a dextrán oldatok emberben is alkalmazhatóak, addig a ficoll, mivel polimerizációja során toxikus anyaggal szennyeződik, ezért csak állatkísérletekben alkalmazható. Azon kísérletekben, amelyekben neutrális dextránt használtak tesztmolekulaként a glomeruláris permszelektivitás meghatározására, azt talalták, hogy az albumint vissztartó, a glomeruláris kapilláris fal „kisméretű pórusai”-nak mérete (rs) 48-60 Å (ez az érték megközelítően megfelel 2-4 nm-nek). Azon kísérletekben ahol ficoll polydiszperz oldatát alkalmazták az rs érték hasonlóan a dextránhoz 45-52 Å volt (90, 156, 167). Azonban jelentős terjedelmű kutatómunka (mikropunkciós vizsgálatok és az újabban alkalmazott endogén glomeruláris fehérjék in vivo követése) erősíti meg, hogy a neutrális fehérjék esetében az rs érték mindössze 37-38 Å (168). A dextrán D-glucopyranose lineáris polymerje, amely hajlékony, változó alakú szerkezetet alkot. A változó térszerkezetű tulajdonsága miatt használatát a glomeruláris vizsgálatokban megkérdőjelezték (81, 92, 156, 159). A ficoll (szukróz polimer) térszerkezetét sok ág jellemzi, az ágak egymással összeköttetésben vannak, így alkotnak együttesen egy gömb alakzathoz hasonló, stabil szerkezetet. Azonban a ficoll oldatban mért belső viszkozitása arra utal, hogy szerkezete átalakul, és inkább vesz fel nyitott, hajlékony alakzatot, amely hasonlóan a dextránhoz megkönnyíti átjutását a glomeruláris barrieren.
41
Összefoglalva
elmondható,
hogy
a
poliszacharidok,
ha
nem
is
tökételes
tesztmolekulák a glomeruláris permszelektivitás vizsgálatában, mégis jobban alkalmazhatóak, mint a neutrális fehérjék. 2.8 Proteinúria Egészséges körülmények között a napi fehérje ürítés nem haladja meg a 30 mg-ot. Különböző patológiás állapotok során ez az érték a napi több grammot is elérheti. A vita, hogy a glomeruláris barrier három rétege közül melyik képezi az igazi határt az albumin vérből a filtrátumba lépésében, évtizes múltra tekint vissza (131, 169-183). Elképzelhető, hogy egészséges körülmények között a barrier bármilyen strukturális elváltozása nélkül, ha a GFR csökken, és a filtrált fehérje nem változik, a vizeletben megjelenő fehérje koncentráció a normális tartományból kilép (142). A jelenlegi álláspont szerint, a GBM töltés szelektivitásának nincs akkora jelentősége, mint azt korábban feltételezték, nem képezi az elsődleges határt az albumin, illetve az egyéb fehérjék filtrációjával szemben. Azonban valószínűsíhető, hogy a GBM és az endothel sejtek felszínét borító glycocalyx negatív töltése, valamint a podocyta slit membránok együttes integritása felelős az albumin és a >70 kDa fehérjék visszatartásáért. Az, hogy normál körülmények között a GBM-ben, vagy a slit membránban lévő albumin hogyan kerül vissza a keringésbe, még nem tisztázott. Több elképzelés létezik azonban. Ilyenek például: tubuláris és glomeruláris reabszorpció, sejtes endocytózis, valamint a slit membránból, az áramlással és nyomással ellentétes irányú, aktív visszaáramlás a vér irányába. Kalluri és munkacsoportja szerint a glomeruláris barrier bármely rétegének sérülése vezethet proteinúriához (178).
42
2.9 A filtrációs modell alkalmazása glomeruláris betegségekre A korábban részletezett, Deen és munkacsoportja által leírt filtrációs modellt pathophysiológás állapotok közül először adriamycin nephrosis esetén alkalmazták (85). Ezek után az említett modellt használták még egyéb glomeruláris betegségekben (minimal change disease, membranózus és diabéteszes nephropathia, valamint preeclampsiás toxaemia) (184-196). A GFR csökkenést az esetek 30-50 %-ában kísérte elváltozás a glomeruláris hemodinamikai paraméterekben, amely azonban nem lehetett felelős a csökkent nettó ultrafiltrációs nyomásért és ezért a csökkent GFR-ért. A GFR csökkenés hátterében az ultrafiltrációs koefficiens (Kf) csökkenését feltételezték. Amint azt korábban leírtuk az ultrafiltrációs koefficiens a glomeruláris kapilláris permeabilitás és a filtrációs felület szorzata. Azaz az említett betegségekben jelenlevő glomeruláris kapilláris permeabilitás csökkenés (GBM megvastagodás) filtrációs
felület csökkenés
(podocyta összefolyás) közvetlenül vezethet a
glomeruláris filtráció csökkenéséhez. 2.10 Összefoglalás PhD munkám célja volt tisztázni az egészséges glomeruláris barrier akusztikus ingerekre való érzékenységét. Munkám során vizsgáltam a glomeruláris barrier funkcionális és szerkezeti változásait a FUS által kiváltott akusztikus hatásokat követően.
Az
általunk
megfigyelt
akusztikus-mechanikus
hatásokra
adott
glomeruláris válaszreakciók, valamint az általunk tervezett FUS eszköz a későbbiekben más kísérletes modellekben, illetve diagnosztikus vagy terápiás lehetőségek kutatásában egyaránt felhasználhatóak lehetnek.
43
3. CÉLKITŰZÉSEK
3.1
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag
egyidejű alkalmazásának a glomeruláris filtracióra kifejtett hatásának tisztázása Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a FUS önállóan, vagy mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyaggal együtt alkalmazva képes biológiai membránok (ilyen például a sejt membrán) átjárhatóságat megnövelni, funkcióját megváltoztatni. Ezenkívül a FUS, mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag egyidejű jelenlétében, a vaszkuláris permeabilitás növekedését idézi elő. A FUS ezen hatását többszörösen leírták a vér-agy-gát integritásának időszakos megszakításának kapcsán. A glomeruláris barrier ugyancsak egy határt képez, a határ ebben az esetben a vér és a vizelet között húzódik. Kísérleteink során célul tűztük ki a FUS és a mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag glomeruláris permeabilitásra, illetve a glomeruláris filtrációra való hatásának tisztázását. 3.1.1 A
Kis és nagy molekulasúlyú anyagok clearance-ének vizsgálata
glomeruláris
permeabilitás
vizsgálatának
bevett
módszere
a
különböző
molekulasúlyú dextránok clearance-vizsgálata. Míg a kis molekulasúlyú (<5000 Da), töltéssel nem rendelkező dextranok szabadon filtrálódnak, addig a nagyobb tartományokba tartozók (≥ 70 000 Da) alig, vagy nem filtrálódnak egészséges vesében. A kreatinin clearance egészséges vesében jó indikátora a vesefunkció követésének. Az említett okoknál fogva, vizsgálataink során különböző molekulasúlyú dextránok és a kreatinin clearance változását követtük a FUS kezelés előtt, alatt és után.
44
3.1.2
A tubuláris funkció vizsgálata
Kísérleteinkben a FUS fókuszhossza megendte, hogy a vese teljes fókusz irányú kiterjedése egy szonikációba beleférjen. Azonban így a glomeruláris állományon túl a vese tubuláris állományát is kezeltük. Tisztázni kívántuk a tubuláris funkció esetleges változását. Ennek érdekében, az irodalom szerint jelentős tubuláris funkció értékeket követtük. 3.1.3
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott esetleges szövettani eltérések
tisztázása A FUS önmagában vagy mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag egyidejű alkalmazásával előidézhet struktúrális abnormalitásokat (vérzés, nekrózis, apoptózis) a kezelt szövetben, szervben. Ennek tisztázása céljából végeztük hagyományos szövettani vizsgálatainkat. 3.2
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott, glomeruláris filtrációban
bekövetkezett változások alkalmazott ultrahangos energia függésének tisztázása Számos adat támasztja alá a FUS kezelés során alkalmazott ultrahang energiafüggő hatását a vér-agy gát áteresztőképességének növelését esetén. A nagyobb energiájú FUS kezelés hatására, a vér-agy gát megnyitása nagyobb eséllyel következik be, illetve azon jelentősebb mennyiségű kemoterápiás gyógyszer juttatható keresztül. Ennek alapján merült fel, a FUS kezelés során alkalmazott ultrahang energia függő hatásának vizsgálata a glomeruláris FUS kezelés esetén. 3.3
A
fókuszált
ultrahang
és
a
mikrobuborék
alapú
ultrahangos
kontrasztanyag glomeruláris barrierre gyakorolt fizikai hatásának tisztázása. Bár a FUS pontos hatásmechanizmusa a biológiai membránok áteresztőképességének növelésében még nem tisztázott, azonban irodami adatok azt támasztják alá, hogy egyes, a membránban elhelyezkedő aktív és/ vagy passzív transzportban résztvevő csatornák funkcionális aktivitás fokozódása szerepet játszhat a folyamatban. Számos adat gyűlt össze annak megerősítésére is, hogy az érfalat alkotó sejtek folytonossága 45
meglazul, vagy megszakad. Elektronmikroszkópos vizsgálataink során azt vizsgáltuk, hogy a FUS kezeléssel kapcsolatba hozható-e a glomeruláris barrier bármely elemének struktúrális eltérése.
46
4. ÁLLATOK ÉS MÓDSZEREK 4.1
Állatok
Az alábbiakban tárgyalt kísérleteket és vizsgálatokat a Harvard Medical Area Standing Committee on Animals jóváhagyta (protokoll szám: 04213). 4.1.1
A fókuszált ultrahang hatása a vese permeabilitására
Ebben a vizsgálatban 17 egészséges új-zélandi, fehér nyúl (hím) bal oldali veséjét kezeltünk fókuszált ultrahang és mikro buborék alapú ultrahangos kontraszt anyag együttes adása mellett. Az állatok jobb veséje szolgált kontrollnak. A vizsgálatban három energiaszintet használtunk és eszerint csoportosítottuk az állatokat. A három akusztikus energia csoport a következő volt: 0,4 W (6 állat), 0,9 W (6 állat) és 1,7 W (5 állat). Ezekben a vizsgálatokban 15 szonikációt alkalmaztunk, amelynek részletes kifejtésére a 4.2.3.2 fejezetben kerül sor. Három állaton végrehajtottuk a kísérlethez szükséges sebészi beavatkozást valamint elvégeztük a méréseket, de ezeket az állatokat nem kezeltük ultrahanggal, ezek az állatok alkották a kontroll csoportot. A kontroll állatok közül egy állat kapott mikro buborékos kontraszt anyagot (2. táblázat). A 9. és a 10. ábra mutatja a kísérleti felszerelést és az idővonalat.
47
2. táblázat: A kísérletek során kezelt állatok csoportosítása. A kontroll csoportba tartozó állatokkal mindenben ugyanúgy jártunk el, mint a FUS kezelt állatokkal, azzal a kivétellel, hogy a kontroll csoportba tartozó nyulak FUS kezelésben nem részesültek. Alkalmazott energia
Állatok száma
kontroll
3
0,4 Watt
6
0,9 Watt
6
1,7 Watt
5 15 szonikáció
9. ábra: A kísérletekben használt kezelőasztal vázlatos képe. Az ábra mellékletében látható a fókusz sík és a 15 szonikáció. PC=személyi számítógép, ADC=analógdigitális átalakító.
48
10 . ábra: A kísérletek időrendje, 15 szonikáció. Az állatot a kezelőasztalra helyeztük, a kísérlet megkezdése előtt 30 percel. A vizeletet (U) 15 perces frakciókban gyűjtöttük, amelyek félidejében vért (B) vettünk az állattól. Az első vizelet frakciót az első dextrán injekció előtt gyűjtöttük. A FUS kezelést (szonikáció) a 7. és a 8. vizeletgyűjtési frakció alatt végeztük
4.1.1.1 Az állatok előkészítése, sebészeti beavatkozás, invazív vérnyomásmérés A hím új-zélandi fehér nyulak (súly: 3000-3500 g) altatásához Xylazine-t és Ketamint használtunk (12 mg/kg/h és 48 mg/kg/h dózisban, i.m.). A jobb fül egyik vénájat használva az infúzió útjának, az állatokat fiziológiás sóoldattal infundáltuk (1 ml/perc sebesség mellett), az altatás megkezdésétől a kísérlet befejezéséig. A bal fül egyik vénájában szintén helyeztünk egy katétert, ez utóbbi szolgált az injekciók beadásának helyéül.
Sebészi beavatkozás A szőrt a test két oldalán kb. 15 cm hosszúságban, illetve a nyakon kb. 10 cm hosszúságban eltávolítottuk. A sebészi beavatkozás első lépéseként, a nyakon hosszanti medián metszésből, felkerestük a bal oldali artéria carotist és egy teljes hosszában 10 cm, zárt rendszerű, katétert 2 cm mélységben helyeztünk az artériába, biztosítva ezzel az invazív vérnyomás méréshez szükséges utat. 49
Második lépésként a jobb oldalon, haránt irányú metszésből, a jobb urétert, lefutásának alsó harmadában felkerestük. Az uréter hólyag felé vezető útját lekötöttük, majd az uréterbe PE 50 méretű katétert helyeztünk, amely a jobb veséből százmazó vizeletet gyűjtötte össze. A műtét harmadik lépéseként a bal oldalon haránt irányú metszésből felkerestük a bal vesét. A vesét a keringés és vizelet áramlás megtartása mellett a testüregből előemeltük. A feltárt vesét kétoldali bőröltés behelyezése mellett rögzítettük. Felszínét steril, testhőmérsékletű (37 ºC) fiziológiás sóoldattal átitatott gézzel beborítottuk, majd száraz gézt helyeztünk rá. A vese testüregből való előemelésére az ultrahangos kezelés egyszerűbb irányítása végett volt szükség. A sebészi beavatkozás utolsó lépése egy, a hólyagba vezetett Foley katéter (Kendall Tyco Healthcare; Mansfield, MA) behelyezése volt, amelynek célja a bal veséből származó vizeletet összegyűjtése volt.
Invazív vérnyomás mérés Az artéria carotisba helyezett katetert a sebészi beavatkozás után csatlakoztattuk egy Grass poligráfhoz (model 7D, Grass Instruments Co., Quincy, MA). A poligráf segítségével a vérnyomás, a kísérlet teljes időtartama alatt mértük, valamint rögzítettük. A poligráf beállításait minden kísérlet előtt ellenőriztük, kalibráltuk. 4.1.2
Energia függő glomeruláris filtráció változás fókuszált ultrahang és
ultrasonográfiás kontraszt anyag együttes alkalmazása alatt Ebben a vizsgálatban 16 egészséges új-zélandi nyúl (hím) bal oldali veséjét kezeltünk fókuszált ultrahang és mikro buborék alapú ultrahangos kontraszt anyag együttes adása mellett. Az állatok jobb veséje szolgált kontrollnak. A vizsgálatban három energiaszintet használtunk és eszerint csoportosítottuk az állatokat. A három akusztikus energia csoport a következő volt: 0,4 W (5 állat); 0,9 W (6 állat) és 1,7 W (5 állat). Ezekben a kísérletekben 30 szonikációt alkalmaztunk, amelynek részletes ismertetésére a 4.2.3.3 fejezetben kerül sor.
50
Négy állaton végrehajtottuk a kísérlethez szükséges sebészi beavatkozást valamint elvégeztük a méréseket, de ezeket az állatokat nem kezeltük ultrahanggal, ezek az állatok alkották a kontroll csoportot (3. táblázat). A 9. ábra mutatja a kísérleti felszerelést, a 11. ábra pedig ezen kísérletek idővonalát. Az állatok előkészítése, a sebészi beavatkozás, valamint a vérnyomás mérés módja megegyezett a korábban (4.1.1.1 fejezet) leírtakkal, ezért itt nem kerül ismét kifejtésre.
3. táblázat: A 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során kezelt állatok csoportosítása.
Alkalmazott energia
Állatok száma
kontroll
4
0,4 Watt
5
0,9 Watt
6
1,7 Watt
5 30 szonikáció
51
11. ábra: A kísérletek időrendje, 30 szonikáció. Az állatot a kezelőasztalra helyeztük, a kísérlet megkezdése előtt 30 percel. A vizeletet (U) 20 perces frakciókban gyűjtöttük, amelyek félidejében vért (B) vettünk az állattól. A FUS kezelést a 2., 3. és 4. vizelet gyűjtési frakcióban végeztük.
4.2
Módszerek
4.2.1
A kísérletek időrendi leírása
4.2.1.1 A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára Ezen kísérletekben az állatok előkészítése és a sebészeti beavatkozás megközelítőleg 90 percet vett igénybe. Az állatokat ezt követően a kezelőasztalra helyeztük és 30 percig vártunk a kísérlet elkezdésével. Ezen idő alatt az új körülményekhez (testüregből előemelt vese, katéterek biztos áramlása) való alkalmazkodást, a katéterek működésének stabilizálódását vártuk. A kísérlet alatt összesen 13 frakcióban gyűjtöttünk vizeletet, minden frakció gyűjtése 15 percet vett igénybe. (Kivéve a 6. számú frakciót, amely az esetek egy részében kb. 5 perccel hosszabb volt, mert az ultrahang készülék utolsó beállítását ezen időtartam alatt végeztük, 10. ábra).
52
4.2.1.2 Energia függő glomeruláris filtráció változás fókuszált ultrahang és ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes alkalmazása alatt Az állatok előkészítése, a sebészeti beavatkozás, valamint a stabilizációs időszak a korábbiakhoz hasonlóan történt. Ezekben a kísérletekben a vizeletet 20 perces frakciókban gyűjtöttük és minden frakció félidejében a carotis katéteren keresztül vért vettünk az állatoktól. Az első mintavétel szolgálta a kezelés megkezdése előtti funkcionális állapot felmérését. Ezekben a kísérletekben a FUS kezelés 60 percig tartott és mivel ezek a kísérletek a FUS kezelés akut hatásainak vizsgálatát szolgálták összesen 4 mérést végeztünk (11. ábra). 4.2.2
A kezelőasztal
A sebészeti beavatkozást követően az állatokat egy általunk készített kezelőasztalra helyeztük. (9. ábra). A kezelőasztal az alábbi elemekből állt. Műanyag, víz tárolására szolgáló tartály, amelynek a méretei a következők: 75 x 50 x 55 cm. A víztároló tartály tetejét egy levehető, akusztikusan áteresztő, műanyag membrán szolgálta. Erre a membránra egy középső részén 3 x 5 cm nagyságú, téglalap alakú lyukkal bíró fedőlemezt tettünk. A kísérletben vizsgált állatot erre a fedőlemezre helyeztük. A kezelőasztal további részei: fókuszált ultrahang transzducer, a transzducer mozgatását biztosító kézi beállító egység, valamint az ultrahang sugár vezérlését szolgáló személyi számítógép, funkció generátor, erősítők, teljesítménymérő, analóg-digitális átalakító (ADC). A kísérletek előkészítése során a víztároló tankot feltöltöttük hideg desztillált vízzel, majd ezt a vizet gázmentesítettük, az erre a célra házilag készített berendezés segítségével. A gázmentesítő berendezés működési elvét az alábbiakban foglajuk össze. A vizet egy olyan filteren pumpáljuk át, amely áteresztő a gáz számára, de a víz számára nem. A filter másik oldáláról vákuum pumpa biztosítja, hogy a gáz elhagyja a vízteret. Annak érdekében, hogy a gázmentesített víz a kísérlet megkezdéséig gázmentes maradjon, egy keringető rendszert építettünk az eszközbe, amely a gáztalanítás folytonosságát fenntartotta. A gázmentesítés hitelesítését Chemets oldott oxigén indikátor (Chemetrics, Inc, Calverton, VA, USA) felhasználásával végeztük.
53
Miután a deionizált víz gázmentesítése befejeződött, a fókuszált ultrahang transzducert betettük a kézi vezérlőegység foglalatába. Ezt követően a tank tetejére raktuk az akusztikusan áteresztő membránt, majd a fedőlemezt. Átlátszó, műanyag fóliát tettünk a fedőlemezre, úgy, hogy a fóliát átvezettük a 3 x 5 cm nagyságú lyukon és belsejébe gázmentesített deionizált vizet tettünk. Az így keletkezett műanyag zsákban, a gázmentesített vizet melegítettük, hőmérsékletét ~ 37 ºC-on tartottuk. Amint az állatot a kezelőasztalra felhelyeztük, annak bal veséje az említett zsákban helyezkedett el. 4.2.3
A fókuszált ultrahang
4.2.3.1 A transzducer Az akusztikus erőtér létrehozásához egy gömb felszínű transzducert használtunk. A transzducer házilag készítettük, a jellemzői az alábbiak voltak: frekvencia: 260 kHz, átmérő/gömb felszín arány: 10/8 cm. A transzducer irányításához egy generátort (Model 276, Fluke, Everett, WA, USA) és egy rádiófrekvenciás erősítőt (model 240L, E&I Inc, Rochester, NY, USA) használtunk. Az elektromos energiát egy erőmérő (model E419B, Agilent, Santa Clara, CA) és egy két irányú csatoló (model C5948-10, Werlatone, Brewster, NY, USA) segítségével mértük. A transducer jellemzői a következők voltak (71). A félintenzitású hullám fókusz átmérője és hosszúsága 8 és 40 mm volt. Feltételeztük, hogy ennél a hosszúságú fókusznál, bármilyen utrahang által kiváltott hatás a nyúl vese teljes “y”-irányú kiterjedésén érvényesülne, azaz a vese a fókuszon belül helyezkedett el (12. ábra).
54
12. A szonikációk elhelyezkedése. A 260 kHz frekvenciájú, 10/8 cm átmérő/gömb felszín arányú, gömb felszínű transzducer segítségével hoztuk létre a szonikációkat, amelyeket úgy helyeztünk el, hogy a vese teljes vastagsága (lásd. később) a fókuszban helyezkedjen el.
A FUS kezeléshez használt ultrahang frekvenciát a Focused Ultrasound Laboratory korábbi tapasztalatai alapján választottuk ki. Alapul tekintettük a vér-agy gát átjárhatóságát biztosító korábbi kísérleteket, a 260 kHz frekvencia bizonyult az agyi kezelések során a legbiztonságosabbnak. Azaz, ennél a frekvenciánál volt a legkisebb a kezelést követő vérzés esélye (77). A nagy méretű fókusz segítségével, viszonylag rövid idő alatt (30 perc), a vese aránylag nagy hányadát (megközelítőleg a vese teljes térfogatának felét, lásd: 4.2.5 fejezet) tudtuk kezelni.
55
4.2.3.2 A szonikációk - A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára Minden kezelési pont (szonikáció) harminc 10 ms pulzusból állt, ahol az ismétlési frekvencia 1 Hz volt. A célpontokat egy síkban, a veseszövetben megközelítően 1 cm mélységben helyeztük el. Tizenöt célpontot kezeltünk, egy cm-es távolságonként, és így a teljes 3 x 5 cm téglalap alakú nyílást, amelyben a vese elhelyezkedett, lefedtük (9. ábra, melléklet). Amint az az ábra mellékletében látszik, egyes szonikációk nem a vesén belül helyezkedtek el, hanem a vesét körülvevő vízben. Számításaink szerint a FUS kezelés során a vese teljes térfogatának megközelítően az 50%-át értük el. (Az említett számítások részletei a következő, 4.2.4 fejezetben talalhatóak). 4.2.3.3 A szonikációk – Energia függő glomerularáris filtració változás fókuszált ultrahang és ultrasonográfiás kontraszt anyag együttes alkalmazása alatt A szonikációk frekvenciája megegyezett a korábbi kísérletekben használttal. Az első 15 szonikációt a korábbi kísérletekkel megegyező módon helyeztük el (4.2.3.2 fejezet). A további 15 szonikációt a képalkotó ultrahang információi alapján azon szonikációk közé helyeztük el, amelyeket a vesébe elhelyezettnek találtunk (13. ábra).
56
13. ábra: Fókusz sík a 30 szonikációt alkalmazó kísérletek során. A szaggatott vonallal jelölt körök mutatják az első 15 szonikációt, a folyamatos vonallal, narancssárgán jelölt körök mutatják a további 15 szonikációt, amelyek a képalkotó ultrahang információ szerint a vesében helyezkedtek el.
4.2.3.4 Az akusztikus energia Három különböző akusztikus energiát használtunk a kísérletek során: 0,4 W; 0,9 W és 1,7 W, ezek az expoziciós szintek megfeleltek a becsült térbeli csúcsnak. Az átmeneti, legnagyobb negatív nyomás amplitudó 0,30; 0,41; és 0,58 MPa volt a fókusz síkjában, 6,5 Np/m/MHz akusztikus gyengülést feltételezve (az átlagos gyengülési értékek a 77. hivatkozásban vannak részletezve). Minden egyes szonikáció megkezdésekor egy, 10 µl/kg gáz alapú ultrahangos kontraszt anyagot (Definity®, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA, USA), juttattunk intravénásan (jobb fülbe helyezett vénás katéteren keresztül) a vizsgált állatba. A kontrasztanyagot tartalmazó injekciót követően 1 ml fiziológiás sóoldatot adtunk be a vizsgált állatnak. A sóoldat a kontrasztanyag katéterből való kiürítését szolgálta. Az egyes szonikációk között megközelítőleg 2 perc telt el, ami alatt a buborékos kontrasztanyag a vérből kitisztult. A veséből származó akusztikus jel követésére egy hidrofont (víz alatti mikrofon) használtunk. Ennek paraméterei a következők voltak. A transzducer körül, gyűrűszerűen (belső/külső átmérő: 13/15 cm) elhelyezve, 10 piezoelektrikus elem, alkotta a hidrofont. A transzducer és a hidrofon elhelyezkedését az 9. ábra mutatja. Minden egyes pulzus esetében a teljes 10 ms kibocsátott szignált rögzítettük, 10 57
megasamples/s sebességgel. Az emissziós szignál rögzítéséhez egy nagy sebességgű digitalizáló kártyát használtunk (model PCI-5124, National Instruments, Austin, TX, USA). A frekvencia spektrum létrehozásához az adatok fast-Fourier átalakítását használtuk, Matlab (version 7.0, The Mathworks, Natick, MA) segítségével. A detektor rezonáns frekvenciája (650 kHz) körüli emisszió szélessávú emissziónak értelmezhető, amely inerciális kavitációra vagy ultraharmonikus emisszióra (az ultrahang frekvencia 5/2 részénél), amely viszont stabil kavitáció jelenlétére utalhat. A FUS kezelés megkezdése előtt, az ultrahangos kontrasztanyag beadása nélkül, az akusztikus emissziót rögzítettük egy szonikációs helyen, amely annak az üregnek a közepén volt, amelybe a vizsgált állatból előemelt vesét helyeztük. 4.2.4
A képalkotó ultrahang
A 30 szonikációt tartalmazó kísérteleteknél a szonikációk elhelyezéséhez az Ultramark 9 Ultrasound System (Advanced Technology Laboratories, Bothell, Washington, USA) képalkotó ultrahang berendezést használtuk fel. A képalkotó ultrahang transzducer a kezelőasztalhoz rögzítve, a gázmentesített vízben foglalt helyet, a készülék képernyőjén a vese volt látható. Amennyiben a szonikáció a vesében foglalt helyet, akkor a szonikációnak megfelelő helyen a mikrobuborékok eltérő mozgása, viselkedése miatt villogó, a környező területnél jelentősen világosabb rész ábrázolódott (a villogó terület mérétei a fókusz méretnek megfelelőek voltak). 4.2.5
A kezelt vesetérfogat megbecslése
A kezelt vesetérfogat megbecsülését ezen dolgozatban foglalt kísérletektől eltérő, de azonos fajtájú állatokon (új-zélandi fehér nyúl) hajtottuk vége. A mérések MRI képeken történtek, amelyekhez feltételeztük, hogy a szonikációk által érintett terület átmérője megegyezett az ultrahang sugár fél intenzitású sugár átmérőjével (8 mm), valamint, hogy a vese teljes vastagsága (y tengely irányú kiterjedése) érintve volt a FUS sugár által (annak irányával megegyezően).
58
4.2.6
Funkcionális vizsgálatok
A 4. és az 5. táblázat összefoglalja a 15, illetve 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során elvégzett vizsgálatokat. 4. táblázat: A 15 szonikációt tartalmazó kísérletek során elvégzett vizsgálatok csoportosítása.
Vizsgálatok összefoglalása – 15 szonikáció Kismolekula clearance Nagymolekula clearance/ Glomeruláris permeabilitás
Kreatinin clearance Dextrán 3 000 Da clearance Dextrán 70 000 Da clearance Protein/Kreatinin hányados GGT/Kreatinin hányados FENa%
Tubuláris funkció
TRP% HE
Szövettan
PAS
5. táblázat: A 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során elvégzett vizsgálatok csoportosítása. Vizsgálatok összefoglalása - 30 szonikáció Kismolekula clearance
Kreatinin clearance
Proteinúria
Protein/Kreatinin hányados GGT/Kreatinin hányados
Tubuláris funkció
FENa% TRP%
Szövettan Ultrasruktúrális vizsgálat
HE PAS Elektronmikroszkópos feldolgozás
59
4.2.6.1 Vér és vizeletgyűjtés, a minták feldolgozása A kísérletek során tizenöt perces frakciókban gyűjtöttük a vizeletet, minden vizelet frakcióvétel félidejében az artéria carotisba helyezett katéterből 0,7 ml vért vettünk, majd azt EDTA-vel bevont centrifuga csőbe helyeztük. A kísérlet végén a vizelet mintákat 3000 rpm fordulatszám mellett 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszóból 2 x 200 µl-t a fluoreszcens vizsgálathoz felhasználtunk a vizelet maradék felülúszót -20 ºC-on további feldolgozásig tároltuk. A vérmintákat 4000 rpm fordulatszám mellett 10 percig centrifugáltuk, majd a plazmát leválasztottuk. Ezen minták esetében is 2 x 200 µl-t használtunk fel a fluoreszcens vizsgálathoz. A maradék plazmát -20 ºC-on további feldolgozásig tároltuk. 4.2.6.2 Glomeruláris méret szelektivitás vizsgálata A FUS kezelés okozta esetleges glomeruláris méret szelektivitásban bekövetkezett változásokat intravénásan beadott, majd a vizelettel ürített fluorescens, töltéssel nem rendelkező különböző méretű dextranok clearancéből mértük fel. A beadott dextranok a
következők
voltak:
dextran
3000
Da
(jelölés:
Rhodamine
Green,
abszorpciós/emissziós maximum: 502/527 nm, Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR, USA), dextran 70 000 Da (jelölés: Rhodamine B, abszorpciós/emissziós, maximum: 570/590 nm, Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR, USA). A kísérletek megkezdése előtt, a dextán 3000 Da és a dextrán 70 000 Da poralakú készítményt steril fiziológiás sóoldatban feloldottuk úgy, hogy az elkészített oldat koncentrációja 1mg/ml, illetve 2 mg/ml legyen. A kísérletek megkezdése előtt, egy alkalommal, a dextrán oldatokból higítási sort készítettünk. A különböző koncentrációjú dextrán oldatokat nyúl friss plazmájával vagy vizeletével kevertük össze. Ezen minták floureszcens jelintenzitását megmértük, és azt találtunk, hogy a kísérletekben felhasznált fluoreszcens dextránok nyúl plazmában és vizeletben egyenlő mértékben oldódnak. A kísérlet során két alkalommal, az állatoknak a következő mennyiséget adtuk be, dextrán 3000 Da: 0.125 ml/kg, dextrán 70 000 Da: 0.187 ml/kg. Az első injekciót az első mintavételt követően, a másodikat pedig a FUS kezelés után adtuk be. A dextrán injekciókat minden esetben 1 ml steril fiziológiás sóoldat injekciója követte. 60
A kísérletek során gyűjtott vérmintákból származó plazma, illetve a vizelet minták fluoreszcens intenzitását egy “fluorescent microplate reader” (Gemini Fluorescent Microplate Reader; Sunnyvale, CA, USA) segítségével határoztuk meg. A dextrán clearance-t a következőképpen számoltuk ki (Eq.1.). Dextrán Clearance = UD/PD*UV
(Eq.1.)
Ahol UD, dextrán vizeletben mért fluoreszcens intenzitása (U/L), PD, dextrán fluoreszcens intenzitása plazmában (U/l) és UV, a gyűjtött vizelet percenkénti mennyisége (ml/min). 4.2.6.3 A laborparaméterek mérése A vizelet és a plazma kreatinin, nátrium, foszfát és a vizelet fehérje koncentrációkat, gamma-glutamyltransferase (GGT) aktivitást rutin laboratóriumi módszerek, “Hitachi 912 chemical analyzer” (Roche Diagnostics, GmbH, Germany) segítségével mértük. 4.2.6.4 A glomeruláris filtrációs ráta kiszámítása A glomeruláris filtrációs ráta kiszámításához a kreatinin clearance meghatározását használtuk fel. Kreatinin Clearance = UCr/PCr*UV
(Eq.2.)
Ahol, UCr, a vizeletben mért kreatinin koncentráció (mmol/l), PCr, a plazmában mért kreatinin koncentráció (mmol/l) és UV, a gyűjtött vizelet percenkénti mennyisége (ml/min).
61
4.2.6.5 A proteinúria, tubuláris funkció megbecsülése Minden vizeletfrakcióból meghatároztuk a fehérje/ kreatinin és GGT/ kreatinin arányt. A fehérje kreatinin hányados refernecia értékét a kontroll állatok vizelet mintáiból határoztuk meg gausz eloszlás szerint (202). Majd az általunk nyert normál tartományt összehasonlítottuk az irodalomban leírt, egészséges nyulak fehérje kreatinin hányadosával (203). Ezen kívül meghatároztuk a frakcionált nátriumürítés (FENa%), illetve a tubuláris foszfát reabszorpció mértékét.
4.2.7
FENa% = UNa/PNa*PCr/UCr*100
(Eq.3.)
TRP% = (1-UP/PP*PCr/UCr)*100
(Eq.4.)
Szövettani vizsgálatok
4.2.7.1 A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára Az állatokat a FUS kezelés befejezését követően 90 perccel Euthasol 100 mg/ttkg dózisú injekciójával elaltattuk. A 90 perc túlélési időt a FUS kezelés funkcionális hatásainak időtartamának meghatározása céljából választottuk így. Mind a kezelt, mind a kontroll vesét azonnal kivettük az állatból, 10%-os formalin oldatban fixáltuk, később paraffinba ágyaztuk és a paraffinos blokkokból széria metszeteket készítettünk. Minden 50. metszetet Hematoxilinnal és Eozinnal (HE) és minden 51. metszetet Periodic Acid Schiff (PAS) festéssel festettünk. A metszetek értékelése a minta származásának (kezelt vagy kontroll vese) ismerete nélkül történt.
62
4.2.7.2 A fókuszált ultrahangkezelés mechanikai hatása a glomeruláris barrier-re Ebben a vizsgálatban a FUS kezelés azonnali hatásainak meghatározását tűztük ki célul, ezért az állatokat a FUS kezelés befejezését követően azonnal Euthasol 100 mg/ttkg dózisú injekciójával elaltattuk. Mind a kezelt, mind a kontroll vesét azonnal eltávolítottuk az állatból. A veséket kereszt irányban kettévágtuk, majd az egyik „félvesét”
10%-os
formalin
oldatban
fixáltuk,
míg
a
másik
„félvesét”
elektronmikroszkópos feldolgozásra tettük félre (ennek leírása a következő fejezetben található). Egyebekben a szövettani feldolgozásban az előző leírás szerint jártunk el. 4.2.8
Elektronmikroszkópos vizsgálatok
4.2.8.1 A minták előkészitése, fixálása, beágyazása A veséket, miután az állatokból eltávolítottuk ketté vágtuk, az egyik “félvesét” a hagyományos szövettani feldolgozás során használtuk fel, míg a másik “félvesét” elektronmikroszkópos feldolgozás számára készítettük elő, amelyhez Hayat protokollját használtuk (199). A “félvesét” 4 ºC-os glutáraldehid tartalmú fixálóban (2,5% glutaraldehid 0,1 M nátrium cacodylat pufferben), jég felett szeleteltük (13. ábra), a FUS sugárra merőleges irányba, úgy, hogy a szeletek ~1 mm vastagságúak legyenek (14. ábra). A “félvese” alapú szeletekből újabb szeleteket készítettünk, hasonlóan az előzekben leírtakhoz, a FUS sugárra merőleges irányba, úgy, hogy a keletkezett szövethasábok alapja megközelítően egy négyzet legyen (1 mm x 1 mm).
63
14. ábra: A minták előkészítése az elektronmikroszkópos feldolgozásra. A veséket a kísérlet befejezését követően azonnal eltávolítottuk, kettévágtuk, majd az egyik “félvesét” hagyományos szövettani feldolgozásra bocsátottuk, míg a másikat az ábrán látható szeletelést követően elektronmikroszkópos feldolgozásra használtuk fel.
64
Az íly módon keletkezett szövethasábokat egyenként, friss, 4 ºC-os glutáraldehid tartalmú fixálóban, hűtőszekrényben 2 órán keresztül előfixáltuk. Ezután a szövethasábokat eltávolítottuk a fixáló oldatból és újból felvágtuk, úgy, hogy ennek eredményeképpen 1 mm oldalhosszúságú szövet kockákat kapjunk. Az íly módon keletkezett szövet kockákat friss, 4 ºC-os glutáraldehid tartalmú fixálóban, hűtőszekrényben 16 órán keresztül fixáltuk. A fixálás után a mintákat 3 x 10 percig mostuk 0,1 M nátrium cacodylat pufferben (pH 7,3; 4 ºC). A mintákat utófixáltuk 1%os ozmium tetroxid- 0,1 M nátrium cacodylat puffer segítségével (pH 7,3; 4 ºC). Majd a mintákat újra mostuk először 0,1 M nátrium cacodylat pufferben, majd desztillált vízben (3 x 15 perc). Ezt követően a mintákat felszálló etanol sorral dehidráltuk és aralditba beágyaztuk. 4.2.8.2 Az elektronmikroszkópos feldolgozás Az aralditba ágyazott blokkokból átnézeti metszeteket (500 nm vastagságú) készítettünk és toluidin-kék festékkel (1% toluidin kék, 1% boraxban) megfestettük, majd fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk. A glomerulusokat ezeken a metszeteken megkerestük, és ezt követően úgy faragtuk be a blokkot, hogy a kisebb méretű, ultravékony metszéshez szükséges blokk felszín tartalmazzon legalább 1-3 glomerulust. Ultravékony metszeteket (100 nm vastagságú) készítettünk, majd ezeket szén tartalmú rácsra rögzítettük és 1%-os uranil-acetát segítségével kontrasztosítottuk. A metszeteket Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) traszmissziós
elektronmikroszkóp
elektronmikroszkópos
felvételeket
segítségével a
AMT
2k
dolgoztuk CCD
kamera
fel.
Az
(amely
az
elektronmikroszkóp része) segítségével készítettük. A podocyta távolságokat az elektronmikroszkópos képeken, az AMT image capture engine szoftverrel (szintén az elektronimkroszkóp része) mértük meg.
65
4.2.8.3 Az elektromikroszkópos mérések Elektronmikroszkópos méréseket végeztünk a kontroll (FUS nem kezelt), és a kezelt csoportokba tartozó (0,4 W; 0,9 W és 1,7 W) állatok mintáiból, úgy, hogy a méréseket végző személy nem tudta, hogy melyik minta melyik csoportba tartozik. Minden araldit blokkból 3 ultravékony metszetet készítettünk, amely metszetenként 3-5 glomerulust tartalmazott. Minden glomerulusban 3 különböző helyen mértük meg a podocyta távolságokat, 30 000X nagyítás mellett (így 1 látótérben ~5-7 podocyta távolságot mértünk meg). Az egy látótéren belüli mérések átlagát vettük, majd az így keletkező 3 érték jellemezte az adott glomerulusban lévő podocyta távolságot, illetve az egy metszeten belüli 3 (glomerulus) x 3 (glomerulusonként 3 hely), azaz 9 érték jellemezte az adott mintában lévő podocyta távolságot. 4.2.9
Az adatok statisztikai elemzése
4.2.9.1 A fókuszált ultrahang hatása a vese kis és nagy molekula filtrációjára 4.2.9.1.1
A relatív funkcionális paraméter meghatározása, a FUS kezelés
hatásának számítása Minden kísérleti állatban, az összes frakcióban meghatároztuk a bal (kezelt) és a jobb (kontroll) vese funkcionális paramétereinek hányadosát. Ezeket a későbbiekben relatív dextrán, kreatinin clearance, vizelet áramlás, stb névvel jelöltük. Ahhoz, hogy össze tudjuk hasonlítani a FUS kezelést megelőző, a kezelés alatti és a kezelést követő funkcionális értékeket, a relatív méresek átlagát vettük. Így a FUS kezelést megelőző értéket, a relatív paraméter 2-5. mérés közötti átlagából nyertük. A FUS kezelés alatti és közvetlen utáni értéket, a relatív paraméter 7-9. mérés közötti átlagából nyertük. A FUS kezelést követő funkcionális paraméter értéket, a relatív paraméter 10-13. mérés közötti átlagából számítottuk ki. A 6. mérést a clearance számításokban nem használtuk fel, mert néhány kísérletben ez a frakciógyűjtés hosszabb volt mint a többi mérés során. Ennek oka az volt, hogy a 6. frakció gyűjtés során állítottuk be a transzducer pontos helyzetét (az adott kísérletben szereplő állat
66
veséjének elhelyezkedéséhez képest), illetve ekkor aktiváltuk a buborékos kontraszt anyagot. Az adatok statisztikai elemzését a SPSS 17.0 statisztikai program segítségével végeztük. 4.2.9.1.2
Power analysis
A power a vizsgálat erejét mutatja meg. Alkalmas arra, hogy a kimutatandó különbséghez megadjuk a szükséges mintaszámot, vagy fordított esetben egy adott mintaszámhoz meghatározzuk a legkisebb kimutatható különbség mértékét. Vizsgálatainkban az α értékét 0,05-ként, a β értékét (power) 0,8-ként határoztunk meg. 4.2.9.1.3
A normál eloszlás vizsgálata
A Kolgomorov-Smirnov teszt a statisztikában meghatározza mintákon mért adatok közötti különbségek eloszlását és azt összehasonlítja az úgynevezett „normál eloszlással”. Vizsgálatainkban a Kolgomorov-Smirnov tesztet használtuk fel annak eldöntésére, hogy a méréseink normál eloszlást mutatnak-e. 4.2.9.1.4
A páros t-próba
A paraméteres módszerek feltételezik, hogy adataink normális eloszlású sokaságból származnak. Két normális eloszlás összehasonlítása az átlagaik és a szórásaik összehasonlítását jelentik, azonos szórások esetén csupán az átlagokat kell összehasonlítani. A két csoportot összehasonlító paraméteres próbák (t-próbák) az átlagos változást vizsgálják, nullhipotézisük az, hogy a két vizsgált sokaság átlaga azonos (1=2). Önkontrollos kísérletek esetén az adatpárok különbségét véve egyetlen adatsort kapunk, a normalitás feltétele erre a különbség-adatsorra vonatkozik. A módszer neve páros t-próba vagy régebbi nevén egymintás t-próba a különbségre. A vizsgálataink során mind a FUS által kiváltott hatás, mind ezen hatás átmeneti voltának statisztikai szignifikanciájának igazolására páros t-póbát használtunk. A FUS által kiváltott hatás szignifikanciájának igazolásásra a FUS kezelés alatti és közvetlen
67
utáni (relatív frakció 7-9) mérési átlagokat hasolítottuk a FUS kezelést megelőző (relatív frakció 2-5) mérési átlagához. A FUS által kiváltott hatás átmeneti jellegének statisztikai bizonyításához a FUS kezelést követő (relatív frakció 10-13) mérési átlagokat hasonlítottuk a FUS kezelést megelőző (relatív frakció 2-5) mérési átlagához.
4.2.9.1.5
Kétszempontos varianciaanalízis
Annak eldöntésére, hogy lehetséges-e a különböző FUS energiával kezelt csoportokat a statisztikai elemzés során összevonni, kétszempontos variancia analízist hajtottunk végre. A varianciaanalízis több, azonos szórású, normális eloszlású populáció átlagának az összehasonlítására szolgáló módszer, amelyet ANOVA néven is emlegetnek az angol elnevezés betűinek rövidítéseként (Analysis of Variance). A varianciaanalízis a tpróbák általánosítása több csoport esetére. Azért hívják varianciaanalízisnek, mert az átlagokat hasonlítja ugyan, de ezt többféle módon definiált varianciák segítségével teszi. A varianciaanalízis a teljes adathalmaz össz-szóródását (pontosabban összvarianciáját) vizsgálja abból a szempontból, hogy azt csupán a véletlen ingadozás okozza-e, vagy ahhoz valamilyen más tényező, pl. a csoportok átlagai közötti különbség is hozzájárul. A kísérleti elrendezéstől függően többféle varianciaanalízis létezik. Ha a csoportok függetlenek, de kétféle szempont szerint is vizsgálhatók (a mi kísérleteinkben
idő
és
FUS
energia
szint
varianciaanalízissel hasonlítjuk össze az átlagokat.
68
szerint),
akkor
kétszempontos
4.2.9.2 A fókuszált ultrahangkezelés mechanikai hatása a glomeruláris barrier-re 4.2.9.2.1 A relatív kreatinin clearance meghatározása, a kreatinin clearance és az alkalmazott FUS energia kapcsolata Minden kísérleti állatban, az összes frakcióban meghatároztuk a bal (kezelt) és a jobb (kontroll) vese kreatinin clearance hányadosát. Ezeket a későbbiekben relatív kreatinin clearance, névvel jelöltük. A FUS kezelés maximális hatását a kezelés megkezdése utáni maximális érték és a kezelés
megkezdése
előtti
érték
összehasonlításából
nyértük.
Az
adatok
összehasonlításához, hasonlóan a korábbi kísérletekhez, páros t-próbát használtunk, az SPSS 17.0 statisztikai program felhasználásával. A kreatinin clearance és az alkalmazott FUS energia között vizsgáltuk a két változós lineáris összefüggést, vagy más néven a közöttük lévő korrelációt. A korreláció az ismérvek közötti kapcsolat azon mérőszáma, amely annak szorosságát, illetve intenzitását méri, értéke (korrelációs koefficiens), abszolút értékben 0 és 1 között változik. Ha a korrelációs koefficiens értéke 0, a két paraméter változása között nincsen összefüggés, míg ha a koefficiens értéke 1, a két paraméter változása szoros összefüggést mutat. 4.2.9.2.2 A kétmintás t-próba – a podocyta távolság változás vizsgálata A kétmintás t-próba azt vizsgálja, hogy két külön mintában egy-egy valószínűségi változó átlagai egymástól szigifikánsan különböznek-e. Nullhipotézise, hogy a két mintában a két átlag statisztikai szempontból megegyezik, míg alternatív hipotézise, hogy a két mintában a két átlag statisztikai szempontból nem egyezik meg. Vizsgálatainkban a nullhipotézisünk az volt, hogy a podocyta távolságok átlagai a kontroll (nem kezelt) csoportban és a kezelt (0,4 W; 0,9 W és 1,7 W) csoportokban statisztikai szempontból megegyeznek, alternatív hipotézisünk volt, hogy a vizsgált csoportok podocyta távolság átlagai statisztikai szempontból nem egyeznek meg. A podocyta távolságok átlagok közötti különbégét szignifikánsnak ítéltük, ha p < 0,05.
69
5. EREDMÉNYEK 5.1 A glomeruláris permeabilitás és a glomeruláris filtráció vizsgálata A power analízis alapján az általunk vizsgált csoportok megfelő számú mintát (kísérleti egyedszámot) tartalmaztak. Kolgomorov-Smirnov tesztet alapján a méréseink minden csoportban normál eloszlást mutattak. A kétszempontos variancia analízis szerint a vizsgált mintákon az interakció nem volt szignifikáns, ami arra a következtetésre vezetett bennünket, hogy ezen kísérletekben nem tudtunk FUS energiafüggő hatást találni. 5.1.1 A glomeruláris permeabilitás vizsgálata A FUS kezelés alatt és közvetlenül utána (mintavétel 7-9), a relatív (a kezelt oldal a nem kezelt oldalhoz viszonyítva) dextrán 70 000 Da clearance-ben 1,54-; 1,56-; és 1,70-szeres emelkedést találtunk. Ezek a növekedési értékek egyenként megfeleltek a 0,4; 0,9; 1,7 W akusztikus energia csoportoknak (15. ábra). A relatív dextrán 70 000 Da clearance-ben bekövetkezett növekedést 1,41-; 1,43-; és 1,63-szeres vizelet mennyiség emelkedés kísérte. Ezeket az arányokat szignifikánsan nagyobbnak találtuk (p=0,046; p=0,045; p=0,048 a relatív dextrán 70 000 Da clearance esetében és p=0,045; p=0,020; p=0,048 a relatív vizelet produkció esetében), mint a FUS kezelés megkezdése előtti értékeket. (16. ábra). A FUS kezelés után (mintavétel 10-13) a relatív dextrán 70 000 Da clearance és a relatív vizelet produkciós arányok nem különböztek szignifikánsan a FUS kezelést megelőző értékektől (mintavétel 2-5). A kontroll állatokban nem találtunk szignifikáns változást sem a 70 000 Da dextrán relatív clearance-ben, sem pedig a relatív vizelet produkcióban.
70
15. Átlagos relatív (bal/jobb vese) 70 000 Da dextran clearance változása a kísérletek során. A szonikációkat a szignifikáns átlagos relatív dextrán 70 000 clearance emelkedés kísérte (p=0,046, p=0,045, p=0,048), amely nem volt megfigyelhető a kontroll kísérletek során. (*: p<0,05; **p<0,01, az ábrán az átlag ± standard deviáció látható). N=20.
16. Átlagos relatív (bal/jobb vese) vizelet mennyiség változása a kísérletek során. A szonikációkat szignifikáns relatív vizelet mennyiség emelkedés kísérte (p=0,045, p=0,020, p=0,048), amely nem volt megfigyelhető a kontroll kísérletek során. (*: p<0,05; **p<0,01, az ábrán az átlag ± standard deviáció látható). N=20.
71
5.1.2 A glomeruláris filtráció vizsgálata A FUS kezelés alatt és közvetlenül utána (mintavétel 7-9) a 17 vizsgált állat közül 5 állatban nem találtunk változást a relatív kreatinin, vagy a 3 000 Da dextrán clearance-ben, egy másik állatban viszont jelentősen nagyobb kreatinin és 3 000 Da dextrán clearance emelkedést talaltunk (3-szoros kreatinin clearance és 2,48-szoros 3 000Da dextrán clearance emelkedés). Ezen hat eredményt kiugrónak tekintettük. A fennmaradó 11 állatban a kreatinin és a 3 000 Da dextrán clearance változás a következőképpen alakult. A relatív kreatinin clearance 1,27-; 1,28-; 1,27-szeresére nőtt, míg a 3 000 Da dextrán relatív clearance-e 1,35-; 1,35-; és 1,36-szorosára nőtt a 0,4; 0,9; 1,7 W akusztikus energiájú csoportoknak megfelelően. A különböző akusztikájú csoportok megkülönböztetése nélkül vizsgált változás mind a relatív kreatinin, mind a relatív 3 000 Da dextrán clearance esetében 1,23-szoros növekedés volt. Míg a megfigyelt kreatinin és 3 000 Da dextrán clearance növekedések az egyes akusztikus csoportokon belül nem különböztek szignifikánsan a FUS kezelést megelőző értékektől, addig ha az említett akusztikus energia csoportokat összevontuk, az azokban megfigyelt növekedések szignifikánsak voltak (p=0,04 a relatív kreatinin clearance esetében, és p=0,027 a 3 000 Da dextrán relatív clearance-ben). (17. ábra). A kombinált csoportok számításánál a kiugrú értékeket is belevettük a számításokba. Mint ahogyan azt a módszerek statisztikai elemzések alcímén belül részletezzük, a különböző akusztikai energia csoportok összevonása azért állt módunkban, mert a különböző akusztikus csoportokban megfigyelt relatív clearance növekedés nem függött a FUS kezelés során felhasznált akusztikus energiától. A FUS kezelést követő (mintavétel 10-13) relatív kreatinin és 3 000 Da dextrán clearance értékek nem különböztek szignifikánsan a FUS kezelést megelőző (mintavétel 2-5) értékektől. A kontroll állatokban nem találtunk szignifikáns változást, sem a relatív kreatinin clearance, sem pedig a 3 000 Da dextrán relatív clearance-ben.
72
17. ábra: Átlagos relatív (bal/job vese) kreatinin (felül) és dextrán 3 000 Da (alul) clearance a kísérletek során. A szonikációkat a szignifikáns átlagos relatív kreatinin és dextrán 3 000 clearance emelkedés kísérte (p=0,04; p=0,027), amely nem volt megfigyelhető a kontroll kísérletek során. (*: p<0,05; az ábrán az átlag ± standard deviáció látható. N=20.
73
5.2 A proteinúria és a tubuláris funkció vizsgálata 5.2.1 A proteinúria vizsgálata A FUS kezelést nem követte szignifikáns vizelet protein/kreatinin hányados emelkedés a 0,4 W akusztikus energiájú csoportban. A 0,9 W akusztikus energiájú csoportban a protein/kreatinin hányadost szignifikánsan magasabbnak találtuk a FUS kezelést követően, mint előtte, de az emelkedett érték a normál tartományon belül maradt. A normál protein/kreatinin hányadost nem kezelt, kontroll állatok jobb és bal veséjéből külön gyűjtött vizeletéből határoztuk meg. A legnagyobb (1,7 W) akusztikus energiájú csoportban a relatív protein/kreatinin hányados szignifikánsan emelkedett volt és ez az érték meghaladta a normál tartomány felső határát (18. ábra). Az emelkedett relatív protein/kreatinin hányados 45 perccel a FUS kezelés befejezése után visszatért a normál tartományba.
18. ábra: Átlagos vizelet fehérje-kreatinin hányados a kísérletek során. A FUS kezelés megkezdése előtt (6. mérés), a kezelés alatt (7. és 8. mérés), valamint a kezelés után (9-13. mérés) mért átlagos vizelet fehérje/kreatinin hányados értékek láthatóak. A relatív fehérje/kreatinin hányados maximális növekedését a kezelés megkezdése előtti értékhez hasonlítottuk. A megfigyelt változásokat a 0,9 és az 1,7 W csoportban szignifikánsak voltak. (p=0,002 and p=0,004; az ábrán átlag értékek± standard deviáció látható). N=20.
74
5.2.2 A tubuláris funkció vizsgálata A tubuláris funkció követésére a relatív FENa%-ot, a relatív TRP%-ot és a relatív vizelet GGT/kreatinin hányadost használtuk. Jelentős változást ezen paraméterek közül a relatív FENa%-ban tapasztaltunk a két nagyobb (0,9 W és 1,7 W) akusztikus energiájú csoportban (p<0,05). Mind a 0,9 W, mind az 1,7 W akusztikus energiájú csoportban 1,32-szeres átlagos, átmeneti emelkedést talaltunk az előbbi csoport esetében 3/6 állatban, míg az utóbbi csoport esetében 3/5 állatban. Ezekben az állatokban a relatív FENa% visszatért a normál tartományba 30 perccel a FUS kezelés befejezése után. (19. ábra).
75
19. ábra: A tubuláris funkció változása a kísérletek során. Az ábrán a FUS kezelés megkezdése előtti (mérés 6), alatti (mérés 7-8) és utáni (mérés 9-13) átlagos, relatív FENa% (felső ábra) TRP% (alsó ábra) látható (± standard deviáció látható). N=20.
76
5.3 Szövettani eredmények A hagyományos HE és a PAS festéses szövettani feldolgozás során ép struktúrát találtunk a két kisebb akusztikus energiájú csoportban (0,4 W és 0,9 W). A legnagyobb akusztikus energiájú csoportban (1,7 W) fokálisan 1-2 tubulusban számos vörösvérsejtet találtunk. Az intersticium minden vizsgált metszetben ép volt. A PAS festés mindhárom FUS kezelt csoportban megtartott proximális tubuláris kefeszegélyt mutatott. A tubulusokban abnormális anyagot nem talaltunk. (20. ábra).
20 . ábra: Szövettani feldolgozás. A felső sorban látható a HE festés, az alsó sorban látható a PAS festés. Az alkalmazott legnagyobb energia mellett (1,7 watt), néhány metszetben, egyes tubulusokban kis kiterjedésű intratubuláris vérzés volt megfigyelhető (nyíl). A PAS festés megtartott szerkezetű tubulusokat ábrázolt (60X nagyítás).
5.4 A FUS kezelés során tapasztalt akusztikus emisszió A kavitációs detektor segítségével az egyes szonikációk során keletkező, a buborék alapú ultrahangos kontrasztanyagtól származó “buborék aktivitást” követni tudtuk. A szonikációk jelentős részében ilyen „buborék aktivitás” megfigyelhető volt. (21. ábra). Ezen aktivitások során a passzív kavitációs detektoron, a spectral energián, a rezonáns frekvencia körül nagy növekedés volt látható. Ultrahang emissziók, mind subharmonikusan, mind ultraharmónikusan megfigyelhetőek voltak az ½ és a 3/2 ultrahang frekvenciánál. Ilyen aktivitást nem tapasztaltunk, ha a szonikációs célpont a
77
-50
Db
vízben volt, vagy abban az esetben, mikor a szonikáció a buborék alapú ultrahangos kontrasztanyag beadása előtt történt.
Vesén kívül
-100 0
0.1
Vesében
21. ábra: A szonikációk monitorozása az akusztikus emisszó mérésének segítségével. A pulzus szonikációk során nyert akusztikus spektrum, a felső ábrán nem látható buborék aktivitás (a szonikáció a vesén kívül, a vízben volt), míg az alsó ábra egyértelmű buborék aktivitást mutat (a szonikáció a vesében helyezkedett el).
5.5 A relatív kreatinin clearance növekedés és az alkalmazott akusztikus energia kapcsolata A FUS kezelés alatt (mintavétel 2-4), az átlagos relatív (kezelt vese a nem kezelt veséhez viszonyítva) kreatinin clearance-ben a FUS energia csoportoknak megfelelően (0,4 W; 0,9 W és 1,7 W) 1,06-; 1,34-; és 1,88-szoros emelkedést talátunk, amely a 0,9 W-, és az 1,7 W csoportban szignifikáns volt (p= 0,035; p=0,019), (21. ábra). A megfigyelt kreatinin clearance növekedés az alkalmazott energia függvényében változott (R2= 0,998), (22. és 23. ábra).
78
0.2
22. ábra: A relatíve kreatinin clearance változás a 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során. A szürke negyzetek jelölik az egyes kísérletek során mért változást, az üres negyzetek jelölik a csoportonkénti, átlagos relatív kreatinin clearance változást, az error bar a standard deviációt jelöli. N=20.
23. ábra: Az átlagos relativ kreatinin clearance változás és az alkalmazott FUS energia kapcsolata. Az ábrán látható az átlagos relatív (bal/jobb vese) kreatinin clearance emelkedés (a szürke négyzetek a az alkalmazott energia függvényében. R2 = 0,998. N=20. 79
5.6 Proteinuria és a tubuláris funkció vizsgálata Ebben a vizsglatban a FUS kezelést szignifikáns átlagos, relatív protein/kreatinin hányados emelkedés kísérte mindhárom alkalmazott FUS energia mellett (p=0,007; p=0,007; p=0,02), amely az 1,7W csoportban meghaladta
a kontrol csoporton
meghatározott normál értéket. A tubuláris funkciót vizsgáló paraméterekben szignifikáns változást nem találtunk. 5.7 Az ultrastruktúrális feldolgozás A vesék ultrastrukurális (elektronmikroszkópos) feldolgozása során, a FUS kezelésre kreatinin clearance emelkedéssel válaszoló állatokban, szignifikáns növekedést találtunk a podocyta távolságban (1,63; 1,66 és 1,72), mindhárom alkalmazott FUS energia mellett (p=0,01, p=0,001, p=0,001 a 0,4 W; 0,9 W és az 1,7 W csoportoknak megfelelően) (23. ábra). Ez a növekedés a FUS energia függvényében változott (R2=0,997). Azokban az állatokban, ahol a FUS kezelést nem kísérte a kreatinin clearance emelkezése, nem talaltunk a podocyta távolságban eltérést a kontroll állatokhoz viszonyítva (24. ábra).
80
24. ábra: Átlagos podocyta távolság. A FUS kezelésre kreatinin clearance növekedéssel, illetve kreatinin clearance növekedéssel nem reagáló állatokban. A podocyta távolság növekedése mindhárom vizsgált FUS energia mellett statisztikailag szignifikáns volt (p=0,01; p=0,001; p=0,001) azokban az állatokban ahol a FUS kezelést a kreatinin clearance emelkedés kísérte. A podocyta távolságot mikrométerben (µm) mértük.
Az elektronmikroszkópos vizsgálatok során különös figyelemmel kerestük a podocyta lábnyúlvány összefolyások jelenlétét, illetve az esetleges podocyta GBM-ről való leválást. A vizsgált metszetekben sem podocyta lábnyúlvány összefolyást, sem levállt podocytát nem talaltunk. A 25. és a 26. ábra 1-1 elektronmikroszkópos felvételt mutat be, az előbbin látható a megnőtt podocyta távolság, míg utóbbi ábra mutatja a változást nem mutató podocyta távolságot.
81
25. ábra. A podocyta távolság a FUS kezelést (1,7 W) követően, 30 000 X-es nagyítás. Az ábrán látható glomerulus részleten a podocyta távolság növekedése látható.
26. ábra. A podocyta távolság a kontroll veséből, 30 000 X-es nagyítás. Az ábrán látható glomerulus részlet szabályos szerkezetet mutató glomerulusból származott
82
6. MEGBESZÉLÉS A glomeruláris barrier filtrációt meghatározó fizikai alkotói, a vér felől az elsődleges filtrátum irányába haladva a következők: endotheliális réteg, GBM és a podocyta réteg. A glomeruláris barrier permeabilitása az ultrafiltrációs koefficienssel jellemezhető, amely a barrier alkotók fizikai jellemzőinek függvényében, aktívan változó érték (81, 100). A glomeruláris barriert alkotó három réteg egymással „kommunikálva” képes változtatni a glomeruláris barrier permeabilitását. Annak ellenére, hogy ennek a „kommunikációnak” nem minden eleme ismert, bizonyítékok szólnak amellett, hogy a podocytákban lévő kontraktilis elemekből álló szerkezet, a podocyták alakjának változtatására és a podocyta lábnyúlványok közötti távolság aktív változtatására képes (123-125). Ennek élettani szerepe még nem tisztázott, de elképzelhető, hogy a glomeruláris kapillárisban létrejövő nyomásváltozáshoz való alkalmazkodásban van szerepe. Fiziológiás körülmények között a glomeruláris barrier alig átjárható a 40 Å, vagy 70000 Da molekulatömegű neutrális molekulák számára (130). Amint ezt a korai kíséretek is bizonyították a glomeruláris barrier kevésbé áteresztő a negatív töltéssel rendelkező molekulák számára, mint a neutrális molekulák számára, és fordítva a pozitív töltéssel rendelkező molekulák könnyebben lépik át a glomeruláris barriert és kerülnek a vérből az elsődleges filtrátumba, mint a neutrális molekulák. PhD munkám célja volt vizsgálni a glomeruláris barrier akusztikus hatásokra való érzékenységét, tisztázni a FUS hatását a tubuláris funkcióra, valamint ultrastruktúrális vizsgálatok segítségével magyarázatot keresni az általunk megfigyelt változásokra. Az alábbiakban a „3. Célkitűzések” című fejezetben leírtak szerint folytatjuk az eredmények megbeszélését.
83
6.1
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú, ultrahangos kontrasztanyag
egyidejű alkalmazásának a glomeruláris filtracióra kifejtett hatásának vizsgálata 6.1.1
Kis és nagy molekulasúlyú anyagok clearance-nek vizsgálata
Ezekben a kísérletekben azt a feltételezést vizsgáltuk, amely szerint alacsony intenzitású fókuszált ultrahang mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes adása mellett a vese barrier funkcióját megváltoztatja.
A vér-agy gát
megnyitásában sikeresen alkalmazott szonikációs beállításokat felhasználva, a FUS kezelés alatt megközelítően 60%-os növekedést észleltünk a relatív dextrán 70 000 Da clearance-ben. Két egymástól független kis molekulájú anyag, amely a glomerulusban szabadon filtrálódik (kreatinin és dextrán 3 000 Da), megközelítően 30% növekedését találtuk a glomeruláris filtrációban. Ezen relatív clearance változások a FUS kezelés megkezdésekor kezdődtek és visszatértek a kezelést megelőző értékre a FUS kezelés befejezését követő 30 percen belül. Bármi is a mechanizmus, amely felelős a szonikált vesében létrejött funkcionális változásokért, az a tény, hogy a szonikált vese nagyobb mértékben üríti a 70 000 Da molekulatömegű dextránt, illetve ennek a változásnak a hirtelen keletkezése amellett szól, hogy a szonikációk a membrán alkotók átmeneti megváltoztatásában játszhatnak szerepet. Korábbi munkák, amelyek a glomeruláris permszelektivitást és a különböző molekula méretű dextránok glomeruláris filtrációját voltak hivatottak vizsgálni, azt talalták, hogy a 70 000 Da molekulatömegű dextrán elsődleges vizeleti térbe való kerülése nagyon ritkán következik be egészséges körülmények között (90, 92, 156, 159, 167). Ezenkívül az általunk később vizsgált elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményei is arra engednek következtetni, hogy a szonikációk a glomeruláris barrier fizikai paramétereinek (jelen esetben a podocyták közötti távolság) megváltozásával járhatnak (lásd később). Annak ellenére, hogy a glomeruláris filtrációban, a vizelet elválasztásban és a nagymolekulák
clearance-ben
bekövetkezett
növekedést
statisztikailag
szignifikánsnak találtuk, és a kontroll (FUS-sal nem kezelt állatokban) ilyen, vagy hasonló változást nem figyeltünk meg, az eredményeink nagyon változékonyak voltak. Ennek a nagyfokú változékonyságnak a hátterében elképzelhető, hogy a
84
képalkotó rendszer hiánya rejlett. Megfelelő képalkotó rendszer segítségével a szonikációk nagyobb biztonsággal a vesében helyezhetőek el. Ezekben a kísérletekben attól függően, hogy a vese a számára kialakított üregben hogyan helyezkedett el, az adott vesének különböző hányada lehetett a szonikációk által érintve, azaz különböző számú szonikáció helyezkedett el a vesén belül. Az eredmények változékonyságának másik oka az lehet, hogy egészséges állatban a filtráció az állat számára megfelelő szinten van, amely a funkció károsítása nélkül tovább már nem növelhető (a glomeruláris filtráció az equilibriumnak megfelelő szinten van (200, 201). Azaz a kis filtrációs/clearance változást mutató állatok glomerulusaiban a pillanatnyi nyomás viszonyok az equilibriumhoz közelebb estek, mint az ugyanezen paraméterekben nagyobb változást mutató állatokban. Ez a lehetőség magyarázhatná a “mindent vagy semmit” szabályt, amelyet megfigyeltünk ezekben a kísérletekben. Azaz, ha egy állatban változást láttunk a glomeruláris filtrációban/ vizsgált moklekulák clearance-ben, akkor az a változás jelentős volt, míg a többi állatban ilyen változás egyláltalán nem volt megfigyelhető. Az említetteken kívül, a csoportokon belüli kis állatszám is szolgálhat magyarázattal, miért nem sikerült az alkalmazott FUS energiától függő hatást kiváltani. Összefoglalva, annak ellenére, hogy ezek a kísérletek a glomeruláris barrier akusztikus ingerekre való érzékenységét mutatják, ezeknek a kísérleteknek is van számos korláta. Amint azt korábban említettük a szonikációkat képalkotó eszköz felhasználása nélkül helyeztük el a vesében, amely magával vonta az ultrahang sugár megbízható írányításának hiányát és a későbbiekben vezethetett az eredmények változékonyságához. A képalkotó eszköz hiánya miatt kellett a vesét a testből kiemelni, amely szintén befolyásolhatta az eredményeket. Ezenkívül a FUS beállítási paramétereket előzőleg nem állítottuk be a vese számára legmegfelelőbb értékre, ebből adódóan, ha ezeket az értékeket (energia, frekvencia, pulzus időtartam, stb) további kísérletek során optimalizáljuk, kedvezőbb eredmények elképzelhetőek. További kísérletek szükségesek annak tisztázására, hogy a mikrobuborékos ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes adása szükséges-e a várt hatás kiváltásához. Túlélő kísérletek során meghatározhatjuk a FUS krónikus hatását a glomeruláris filtrációra, mind olyan esetben, ha a FUS-t egyszer vagy ismétlődő jelleggel alkalmazzuk.
85
6.1.2
A tubuláris funkció vizsgálata
A vizsgált tubuláris paraméterekben statisztikailag szignifikáns eltérést nem tudtunk kimutatni. A tény, hogy a FENa-ban bekövetkezett változások csak a legnagyobb alkalmazott energia mellett voltak megfigyelhetőek, úgy, hogy a TRP-ben és a vizelet GGT/kreatinin hányadosban jelentős eltérést nem tapasztaltunk, arra utal, hogy ha elképzelhető is volt 1-2 kísérletben a tubuláris funkció változás lehetősége, annak hátterében valószínűleg funkcionális változás áll, és nem szerkezeti eltérés. Összefoglalva elmondható, hogy a kreatinin clearance növekedés minimális tubuláris funkció változással járt, amely arra utal, hogy a szonikációk a GFR növekedését idézték elő, a tubuláris funkció megtartása mellett. Ennek ellenére további kutató munka szükséges, ahhoz, hogy tisztázzuk az általunk megfigyelt dextrán 70 000 Da clearance-ben bekövetkezett változások nem köthetőek-e podocyta károsodáshoz (mint például podocyta leválás a glomeruláris bazálmembránról), vagy endotél sejt károsodáshoz, amely fénymikroszkóp segítségével nem volt megfigyehető. Az ilyen károsodások vezethetnek az általunk megfigyelt nagy molekulasúlyú dextrán clearance növekedéshez. Ezekben a kísérletekben a legkisebb FUS energia szint mellett nem tapasztaltunk növekedést a protein/kreatinin hányadosban, a két nagyobb FUS energiaszint mellett a protein/kreatinin hányados növekedett, de csak a legnagyobb FUS energia mellett lépett át a kóros tartományba. A protein/kreatinin hányados ezekben az állatokban is visszatért a normál tartományba a FUS kezelés befejezését követő 45 percen belül. A protein/kreatinin hányados ilyen változása utalhat tubulus károsodásra, amely létrejöhet nagy FUS energia szint használata esetén.
86
6.1.3
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott szövettani eltérések
vizsgálata Hagyományos HE és PAS festéssel sem a 15 szonikációt, sem a 30 szonikáció tartalmazó kísérletekben nem talaltunk jelentős szerkezeti elváltozást. Néhány metszetben a legnagyobb FUS energia szint mellett, tubuláris vérzést figyeltünk meg, amely megerősítheti azt a korábbi feltételezésünket, amelyet a protein/kreatinin hányados ugyaezen FUS energiaszint mellett megfigyelt növekedéséből vontunk le, miszerint az 1,7 W FUS energiaszint egyes esetekben károsíthatja a vese tubulusokat. 6.2
A fókuszált ultrahang kezelés által kiváltott, glomeruláris filtrációban
bekövetkezett változások, alkalmazott ultrahangos energia függésének tisztázása A 30 szonikációt tartalmazott kísérletekben az első 15 szonikációt a korábbi kísérleteknek megfelelően helyeztük el, míg a második 15 szonikációt a képalkotó ultrahang információi alapján a vesében elhelyezett szonikációk köré helyeztük el. Ezzel a módszerrel a vese nagyobb hányadát sikerült a FUS segítségével kezelni, amelynek segítségével FUS energia függő változást tudtunk előidézni a kreatinin clearance-ben. Ez tovább erősíti azt a feltételezést, miszerint a glomeruláris filtrációban bekövetkezett változások hasonló eredetűek, mint a vér-agy gát átjárhatóvá tételének hátterében álló folyamatok. 6.3
A
fókuszált
ultrahang
és
a
mikrobuborék
alapú,
ultrahangos
kontrasztanyag glomeruláris barrierre gyakorolt fizikai hatásának tisztázása Az elektronmikroszkópos feldolgozás során FUS energia függő változást talaltunk a podocyta távolságban. A podocyta távolság növekedése mindhárom vizsgált FUS energia mellett statisztikailag szignifikáns volt. Ezek az eredmények erősítik azt a feltételezést,
miszerint
a
FUS
mikrobuborék
alapú
ultraszonográfiás
kontrasztanyaggal együttesen alkalmazva a glomeruláris barrier fizikai jellemzőit megváltoztatva vezet a glomeruláris filtráció növekedéséhez. Megfigyelésünk, miszerint a podocyta távolság növekszik és az a glomeruláris filtráció növekedésével jár együtt egybehangzik a Deen és munkatársai által leírt, a
87
glomeruláris barrier szerkezeti elemeit, és azok funkcióit jellemző matematikai modellel. Mivel az általunk megfigyelt podocyta távolság növekedés nem járt együtt podocyta lábnyúlvány összefolyással, vagy podocyta GBM-től való levállással, illetve egyéb a glomeruláris szerkezet károsodásával, ezért feltételezhetjük, hogy az itt leírt változások fiziológiás körülmények között is létrejönnek. További kísérletek szükségesek annak eldöntésére, hogy a pillanatnyi filtráció növekedés létrehozható-e olyan esetekben, mikor a podocyták szerkezete kóros. A
mechanizmus,
amellyel
a
FUS
mikrobuborék
alapú
ultraszonográfiás
kontrasztanyag jelenlétében a glomeruláris filtrációban változást képes előidézni jelenleg még nem tisztázott. Számos biológiai hatás jöhet létre amint a mikrobuborékok ultrahangos erőtérbe kerülnek, amelyek nagyrészt akusztikusmechanikus hatások. Az albumin/lipid burkolatú buborékok kisebb buborékokra hullhatnak szét, amelynek során a keletkező szabad buborékok oszcillálhatnak az ultrahangos erőtérben, illetve az egyenirányított diffúzió miatt kiterjedésükben növekedhetnek. Adott akusztikus nyomás mellett, a pozitív nyomás ciklus során összeeshetnek a buborékok, amely jelenséget inerciális kavitációnak is nevezik, és közben sokk hullámok, nagy sebességű mikro jettek, szabadgyökök és jelentős helyi hőmérsékletemelkedés keletkezik (46-49). Egyéb lehetséges hatások a folyadék buborékok körüli akusztikus áramlása, amely az érfalon jelentős nyíró erő formájában jelenhet meg, vagy a buborékok direkt hatása az érfalra, amely a buborékok oszcillációja illetve a sugárzási erő formájában jelenhet meg. A buborékok oszcillációja az éren belül, okozhat éles, átmeneti nyomás változást, amely szintén vezethet az érfal átjárhatóságának megváltozásához (46-49). Korábbi kisérletekben, ahol azonos beállítási paraméterekkel bíró FUS-t, hasonló mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag együttes adása mellett alkalmaztak (47), azt tapasztalták, hogy ilyen paraméterek mellett jelentős hőmérséklet emelkedés nem fordul elő, és ezért a kiváltott hatásokért a hőmérsékletemelkedés nem tehető felelőssé. A legerőszakosabb esemény, amely a FUS és a mikrobuborékok által kiváltható, az az inerciális kavitáció, amely a szövetben vérzést és szöveti károsodást (nekrózist) okozhat (8-53). Sem intersticiális vérzés, sem egyéb szöveti károsodás nem volt megfigyelhető az alkalmazott FUS energiák mellett, amely arra utal, hogy a FUS kezelést követő glomeruláris funkció változások kiváltásában az inerciális 88
kavitációnak nincs döntő szerepe. Ennek ellenére néhány fokozott akusztikus emisszó detektálható volt a hidrofón rezonáns frekvenciáján, amely megegyezik a szélessávú emisszióval, amely az inerciális kavitáció indikátora. Ez azonban sajnos egybeesett az ultraharmonikus emisszióéval az 5/2 ultrahang frekvencián (amely azonos volt a detektor közép frekvenciájával). Az ilyen emisszió előfordulása viszont elég valószínű, hiszen ultraharmonikus emisszió a 3/2 ultrahang frekvencián szintén megfigyelhető volt. További kísérletekre van szükség egy más kavitációs detektor segítségével, hogy el tudjuk különíteni a megfigyelt akusztikus emisszió eredetét, (szélessávú emisszió – inerciális kavitáció, vagy ultraharmónikus emisszió – stabil kavitáció). Korábbi eredmények, szintén agyi vizsgálatokból, arra utalnak, hogy az inerciális
kavitáció
jelenléte
nem
szükséges
az
agyi
ér
funkcionális
megváltoztatásához (vér-agy gát átjárhatóvá tétele) (68-70). Abban az esetben, ha azonos mechanizmus áll a glomeruláris filtrációban bekövetkező változások mögött, mint ami a vér-agy gát átjárhatóvá tételében szerepet játszik, akkor az inerciális kavitáció kiváltására nincs szükség. Elképzelhető még, hogy a szonikációk aktiváltak egy utat a glomeruáris barrier fiziológiai válaszreakciói közül, amely végül a glomeruláris filtráció átmeneti emelkedéséhez vezetett. Ez a reakció elképzelhető, hogy az efferens arteriola vazokonstriktor és/vagy az afferens arteriola vazodilatációs stimulálásával jár.
89
7. KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeim alapján az alábbi új megállapításokat tettem: 1.
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú ultrasonográfiás kontrasztanyag együttes alkalmazásával a kreatinin clearance és a 3000 Da molekulatümegű dextran clearance növelhető egészséges vesében.
2.
Fókuszált ultrahang és mikrobuborék alapú ultrasonográfiás kontrasztanyag együttes alkalmazásával a 70 000 Da molekulatömegű dextrán (amely normál körülmények között alig lép át a glomeruláris membránon) clearance és a percdiurézis növelhető egészséges vesében.
3.
A FUS kezelés átmeneti proteinuria növekedéssel járt együtt. Az általunk vizsgált két alacsonyabb eneriájú FUS kezelés által okozott proteinuria fokozodás a normál tartományon belül maradt.
4.
A FUS kezelés nem okozott jelentős eltérést tubuláris funkciót mérő paraméterekben.
5.
A fénymikroszkópos vizsgálat szerint a FUS kezelés nem okoz struktúrális eltérést sem a kortikális, sem a medulláris állományban.
6.
Az elektronmikroszkópos vizsgálatok alapján a FUS kezelést követően, egészséges vesében, a podocyta távolság megnőtt, amely kapcsolatban lehet a glomeruláris filtrációban megfigyelt változásokkal.
7.
A szonikációk számának növelésével, és az egyidejű képalkotó ultrahang bevezetésével a FUS kezelés glomeruláris ultrafiltrációra gyakorolt hatása növelhető volt.
8.
A FUS mikrobuborékos ultrasonográfiás kontrasztanyag együttes adása mellett akusztikus energiafüggő hatást vált ki a glomeruláris ultrafiltrációban.
90
8. ÖSSZEFOGLALÁS PhD munkám során a fókuszált ultrahang és a mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag glomeruláris filtrációra, illetve a glomeruláris permeabilitásra gyakorolt hatását vizsgáltam. A kapott eredmények a glomeruláris működés megértésében segíthetnek. Első kísérleteink során kimutattuk, hogy a FUS és mikrobuborék alapú ultrahangos kontrasztanyag együttes alkamazásával, a kreatinin clearance alapján megbecsült glomeruláris ultrafiltració, valamint a 3000 Da molekulasúlyú dextrán clearance növelhető. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy egy normál körülmények között a glomeruláris barrieren alig filtrálódó molekula, a 70000 Da molekulasúlyú dextrán clearance is fokozódik az alkalmazott kezelés mellett. Az említett különböző méretű molekulák clearance fokozódását a vizelet produkció növekedése kísérte. A nagyobb akusztikus energiájú FUS kezelés mellett növekedést találtunk a protein/kreatinin hányadosban és egyes esetekben a FENa%-ban. Mind a megfigyelt clearance növekedések, mind a vizelet produkció növekedése, mind a proteinúria fokozódása és az egyes tubuláris funkcióban bekövetkezett változások átmenetinek bizonyultak. A hagyományos szövettani feldogozás során a legnagyobb akusztikus energiájú FUS kezelés mellett fokálisan tubuláris vérzést talaltunk. Kavitációs
detektor
segítségével
regisztrálni
tudtunk
úgynevezett
„buborék
aktivitások”-at, amelyek stabil, vagy átmeneti kavitáció jelenlétére utaltak. Ezeknek a „buborék
aktivitások”-nak
kontrasztanyag mechanizmusának
együttes
a
FUS
és
alkalmazásával
megértése
a
mikrobuborék kiváltott
szempontjából
lehet
alapú
ultrahangos
glomeruláris
hatások
jelentősége.
Későbbi
kísérleteinkben összefüggést mutattunk ki az alkalmazott akusztikus energiájú FUS kezelés és a kreatinin clearance növekedés között, amely szerint a nagyobb akusztikus energiák jelentősebb relatív kreatinin clearance növekedést váltottak ki. A glomeruláris barrier, elektronmikroszkóp segítségével történt, ultrastrastruktúrális vizsgálata során az alakalmazott kezelést követően, szignifikáns podocyta távolság növekedést találtunk, amely növekedés szintén függvénye volt az alkalmazott akusztikus energiának. Elképzelhető, hogy a podocyta lábnyúlvány távolság növekedése áll a glomeruláris permeabilitás megváltozásának hátterében. Eltérést a glomeruláris barrier egyéb alkotóinak szerkezeti elemeiben nem találtunk.
91
9. SUMMARY During my PhD work I investigated the potential effects of focused ultrasound and microbubble based ultrasonografic contrast agent on the glomerular ultrafiltration and on the glomerular permeability. Our results may help the better understanding of the glomerular function. In our first set of experiments we found increase in the creatinine clearance, as a measure of the glomerular filtration rate, and in the clearance of the 3,000Da dextran. Furthermore we found increase in the 70,000Da molecular weight dextran clearance, a molecule that can barely cross the glomerular barrier in normal circumstances, which was accompanied with urine production rate enhancement. We observed elevation in the protein-to-creatinine ratio and in some cases in the FENa%. Each of the mentioned elevation was found to be temporary after the treatment ended returned back to prior treatment level. The histology examination found normal structure at the lower acoustic power levels, although the highest power level tested was associated with focal tubular hemorrhages. Using the cavitation detector we observed bubble activity suggesting either stable or transient cavitation. These cavitation signs can be significant in the understanding of the mechanism by which FUS and the microbubble based ultrasonographic contrast agent modify the glomerular permeability. In later experiments, we found correlation between the applied acoustic power level and the relative creatinine clearance enhancement, the higher acoustic power resulted greater elevation in the relative creatinine clearance. The overall ultrastructure examination showed intact glomeruar capillary structure in every examined case. Using higher magnification we were able to detect significant increase in the podocyte foot process distance. The magnitude of this increase was dependent on the applied power level. It is possible that the increase in the podocyte foot process distance is responsible for the functional changes in the glomerular permeability.
92
10. TÁBLÁZAT ÉS ÁBRAJEGYZÉK 10.1 Táblázatok jegyzéke 1. táblázat:
A fókuszált ultrahang terápiás felhsználása
2. táblázat:
A kísérletek során kezelt állatok csoportosítása, 15 szonikáció
3. táblázat:
A kísérletek során kezelt állatok csoportosítása, 30 szonikáció
4. táblázat:
A 15 szonikációt tartalmazó kísérletek során elvégzett vizsgálatok csoportosítása.
5. táblázat:
A 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során elvégzett vizsgálatok csoportosítása.
10.2 Ábrák jegyzéke 1. ábra:
Az ultrahang hatásai az akusztikus nyomásamplitudó függvényében
2. ábra:
Gázzal töltött buborékok viselkedése ultrahangos erőtérben
3. ábra:
A fókuszált transzducerek
4. ábra:
A mikrobuborék alapú ultraszonográfiás kontrasztanyag szerkezete
5. ábra:
A glomeruláris filtrációs rendszer
6. ábra:
A glomeruláris kapilláris fal, idealizált, egy filtrációs slitnek megfelelő szerkezeti egysége
7. ábra:
A filtrációs rések szerkezete
8. ábra:
A glomerulus idealizált képe egészséges és epitél/podocyta réteg károsodás esetében
9. ábra:
A kísérletekben használt kezelőasztal vázlatos képe
10. ábra:
A kísérletek időrendje, 15 szonikáció
11. ábra:
A kísérletek időrendje, 30 szonikáció
12. ábra:
A szonikációk elhelyezkedése
13. ábra:
Fókusz sík a 30 szonikációt alaklmazó kísérletek során
14. ábra:
A minták előkészítése az elektronmikroszkópos feldolgozásra
93
15. ábra:
Átlagos relatív (bal/jobb vese) 70 000 Da dextran clearance változása a kísérletek során
16. ábra:
Átlagos relatív (bal/jobb vese) vizelet mennyiség változása a kísérletek során
17. ábra:
Átlagos relatív (bal/job vese) kreatinin (felül) és dextrán 3 000 Da (alul) clearance a kísérletek során
18. ábra:
Átlagos vizelet fehérje-kreatinin hányados a kísérletek során
19. ábra:
A tubuláris funkció változása a kísérletek során
20. ábra:
Szövettani vizsgálat
21. ábra:
A szonikációk monitorozása a
akusztikus emisszó mérésének
segítségével 22. ábra:
A relatíve kreatinin clearance változás a 30 szonikációt tartalmazó kísérletek során
23. ábra:
Az átlagos relativ kreatinin clearance változás és az alkalmazott FUS energia kapcsolata
24. ábra:
Átlagos podocyta távolság
25. ábra:
A podocyta távolság a FUS kezelést (1,7 W) követően, 30 000X-es nagyítás
26. ábra:
A podocyta távolság a kontroll veséből, 30 000X-es nagyítás
94
11. IRODALOMI HIVATKOZÁSOK 1.
Atchley AA, Crum LA. (1988) Acoustic cavitation and bubble dynamics. Ultrasound its chemical, physical, and biological effects: 1-64.
2.
Rooney JA. (1988) Other non-linear acoustic phenomena. Ultrasound its chemical, physical, and biological effects: 65-93.
3.
Wood RW, Loomis AL. (1927) The physical and biological effects of highfrequency sound-waves of great intensity. Phil Mag, 6: 417-436.
4.
Ter Haar GR. (1988) Biological effects of ultrasound in clinical applications. Ultrasound its chemical, physical, and biological effects: 305-320.
5.
Barnett SB, ter Haar GR, Ziskin MC, Nyborg WL, Maeda K, Bang J. (1994) Current status of research on biophysical effects of ultrasound. Ultrasound Med Biol 20(3):205-18.
6.
Barnett SB, Rott HD, ter Haar GR, Ziskin MC, Maeda K. (1997) The sensitivity of biological tissue to ultrasound. Ultrasound Med Biol, 23(6):80512.
7.
Hynynen K. Biophysics and technology of ultrasound hyperthermia. (1990) In: Gautherie M (szerk). Methods of External Hyperthermic Heating. New York: Springer-Verlag.
8.
Frizzell LA. (1988) Biological effects of acoustic cavitation. Ultrasound its chemical, physical, and biological effects: 287-304.
9.
Freed D, Walker WF. Cavitation and Multiphase flow forum. American Sociaty of Mechanical Engineers, New York. 1984.
10.
Fox, F.E. and Herzfeld, K.F. (1954) Gas bubbles with organic skin as cavitation nuclei. J.Acoust Soc Am, 26: 984-989.
11.
Strasberg M. Onset of ultrasonic cavitation in tap water. (1959) J Acoust Soc Am, 31: 163.
12.
Connolly W, Fox FE. (1954) Ultrasonic cavitation thresholds in water, J Acoust Soc Am, 26: 843–848.
13.
Greenspan M, Tchiegg C. (1967) Radiation-induccd acoustic cavitation; apparatus and some results. J Res Nat Bur P Stds, 71C: 299-312.
95
14.
Apfel RE. (1970) The role of impurities in cavitation threshold determination. J Acoust Soc Am, 48: 1179–1186.
15.
Atchley AA, Prosperetti A. (1987) The crevice model of bubble nucleation. J Acoust Soc Am, 48:
16.
Apfel R. In “Ultrasonics”; Academic Press: New York, 1981, Vol. 19, Ch. 7, pp. 355-441.
17.
Willard GW. (1953) Ultrasonically induced cavitation in water: a step by step process. J Acoust Soc Am, 25: 669-74.
18.
Harvey EN, Barnes DK, McElroy WD, Whiteley AH, Pease DC &Cooper KW (1944). Bubble formation in animals, In: Physical factors. J Cell Comp Physiol, 24: 1–22.
19.
Blake FG. (1949) The onset of cavitation in liquids. Tech. memo. No.12, Harvard Acoustics Laboratory.
20.
Apfel RE. (1982) Acoustic cavitation: a possible consequence of biomedical uses of ultrasound. Br J Cancer, 45(suppl): 140–146.
21.
Apfel RE. (1980) In. Cavitation and inhomogenities in underwater aquatics. Springer-Verlag: New York, 79.
22.
Flynn, HG (1982). Generation of transient cavities in liquids by microsecond pulses of ultrasound. Acoust. Soc. Am, 72: 1926-32.
23.
Crum LA, Fowlkes JB. (1986) Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature, 319: 52–4.
24.
Nyborg WL. In: Physical Acoustics. Academic Press, New York. 1965. Vol. 2B., pp. 265-283.
25.
EL Carstensen and HG Flynn. (1982) The potential for transient cavitation with microsecond pulses of ultrasound. Ultrasound Med Biol 8: L720–L724.
26.
Neppiras EA. (1980) Acoustic cavitation. Phys Rep, 61(3):159–251.
27.
Bhadra TC, Roy B. (1975) Proc. Ultrason. Int. IPC Science and Technology, Ross Ltd., Guilford, Surrey, U.K. 253.
28.
Cobb WN (1983) Finite amplitude method for the determination. of the acoustic nonlinearity parameter B A J. Acoust Soc Am 73: 1525–31.
29.
Apfel RE. (1983) The effective nonlinearity parameter for immiscible liquid mixtures. J Acoust Soc Am, 74: 1866–1868.
30.
Nyborg WL, Rooney JA. (1984) Comments on ''Acoustic radiation ... 1673– 1687, J.Acoust. Soc. Am, 75: 263–264. 96
31.
Cornhill CV. (1982) Improvement of portable radiation force balance design. Ultrasonics 20: 282-4.
32.
Coakley WT, Nyborg WL. (1978) In: Ultrasound: Its Applications in Medicine and Biology. Academic Press: New York, 1978, 77-159.
33.
O’Brien WD, Jr. (1978) In: Ultrasound: Its Applications in Medicine and Biology. Fry F. J. (szerk.). Elsevier: New York, Part I, Ch. V. 343-391.
34.
Flynn HG. (1964) In: Physical Acoustics. Mason MP. (szerk). Academic Press. New York. Vol. 1A, Ch. 2.: 57.
35.
Apfel RE. (1981) In: Ultrasonics (Methods of Experimental Physics Series). Edmonds PD. (szerk). Academic Press. New York. Vol. 19. Ch.7: 355-411.
36.
Crum LA. (1979) Tensile strength of water. Nature, 278:148.
37.
Blake FG. (1949) The tensile strength of liquids: A review of the literature. Tech. Memo. No. 9, Harvard Acoustics Research Laboratory.
38.
Bernoulli D. (1738) Hydrodynamica, sive de viribus et motibus fluidorum commentarii, Strassbourg.
39.
Gernez M. (1867) On the disengagement of gases from their saturated solutions. Phil Mag, 33: 379-481.
40.
LA Crum, (1980) Measurements of the growth of air bubbles by rectified diffusion. J Acoust Soc Am, 68: 203-211.
41.
Lewin PA, Bjørnø L. (1981) Acoustic pressure amplitude thresholds for rectified diffusion in gaseous microbubbles in biological tissue. J Acoust Soc Am,
42.
Apfel, R.E. (1981) Acoustic cavitation prediction. J Acoust Soc Am, 69: 1624
43.
Crum, L.A. (1980) Measurements of the growth of air bubbles by rectified diffusion. J Acoust Soc Am, 68: 203-211.
44.
Apfel, RE. (1981) Acoustic cavitation prediction. J Acoust Soc Am 69: 1624.
45.
Crum LA, Hansen GM. (1982) Growth of air bubbles in tissue by rectified diffusion. Phys Med Biol, 27(3):413–417.
46.
ter Haar GR. (2002) Ultrasonic contrast agents: safety considerations reviewed. Eur J Radiol, 41(3):217-21.
47.
ter Haar G. Safety and bio-effects of ultrasound contrast agents. (2009) Med Biol Eng Comput, 47(8):893-900.
48.
ter Haar G. (2008) Bubble trouble? Ultraschall Med, 29(5): 550-1.
97
49.
Ferrara K, Pollard R, Borden M. (2007) Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annu Rev Biomed Eng, 415-47.
50.
Williams AR. (1983) Ultrasound: Biological Effects and Potential Hazards. Academic Press. New York.
51.
Nyborg WL, Ziskin MC. (1985) Biological Effects of Ultrasound. Churchill Livingstone. New York.
52.
Dunn F, Frizzell LA. (1982) In: Therapeutic Heat and Cold. 3rd Edition. Lehmann JF (szerk.). Williams and Wilkins: Baltimore. Ch. II. 77-159.
53.
O'Brien WD Jr. (2007) Ultrasound-biophysics mechanisms. Prog Biophys Mol Biol, 93(1-3):212-55.
54.
Hynynen K, Vykhodtseva NI, Chung AH et al. (1997) Thermal effects of focused ultrasound on the brain: determination with MR imaging. Radiology, 204:247-253.
55.
ter Haar GR. (2001) High intensity focused ultrasound for the treatment of tumors. Echocardiography, 18(4):317-22
56.
Leslie TA, Kennedy JE, Illing RO, Ter Haar GR, Wu F, Phillips RR, Friend PJ, Roberts IS, Cranston DW, Middleton MR. (2008) High-intensity focused ultrasound ablation of liver tumours: can radiological assessment predict the histological response? Br J Radiol 81(967): 564-71.
57.
Wei K, Skyba DM, Firschke C, Jayaweera AR, Lindner JR, Kaul S. (1997) Interactions between microbubbles and ultrasound: in vitro and in vivo observations. J Am Coll Cardiol, 29(5):1081-8.
58.
Price RJ, Skyba DM, Kaul S, Skalak TC. (1998) Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation, 98(13):1264-7.
59.
Bertuglia S. (2007) Mechanisms by which low-intensity ultrasound improve tolerance to ischemia-reperfusion injury. Ultrasound Med Biol, 33(5): 663-71.
60.
Bertuglia S. (2005) Increase in capillary perfusion following low-intensity ultrasound and microbubbles during postischemic reperfusion.Crit Care Med, 33(9): 2061-7.
61.
Bertuglia S, Giusti A, Picano E. (2004) Effects of diagnostic cardiac ultrasound on oxygen free radical production and microvascular perfusion 98
during ischemia reperfusion. Ultrasound Med Biol, (4):549-57. 62.
Kinoshita M, Hynynen K. (2005) A novel method for the intracellular delivery of siRNA using microbubble-enhanced focused ultrasound. Biochem Biophys Res Commun, 23;335(2):393-9.
63.
Dittmar KM, Xie J, Hunter F et al. (2005) Pulsed high-intensity focused ultrasound enhances systemic administration of naked DNA in squamous cell carcinoma model: initial experience. Radiology, 235(2): 541-46.
64.
Huber PE, Pfisterer P. (2000) In vitro and in vivo transfection of plasmid DNA in the Dunning prostate tumor R3327-AT1 is enhanced by focused ultrasound. Gene Ther ,7(17): 1516-25.
65.
Tachibana K, Uchida T, Ogawa K, Yamashita N, Tamura K. (1999) Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet, 353(9162): 1409.
66.
Tachibana K, Uchida T, Hisano S, Morioka E. (1997) Eliminating adult Tcell leukaemia cells with ultrasound. Lancet, 349(9048):325.
67.
Wharton IP, Rivens IH, Ter Haar GR, Gilderdale DJ, Collins DJ, Hand JW, Abel PD, deSouza NM. (2007) Design and development of a prototype endocavitary probe for high-intensity focused ultrasound delivery with integrated magnetic resonance imaging. J Magn Reson Imaging, 25(3):548-56
68.
Hynynen K, McDannold N, Vykhodtseva N, Jolesz FA. (2001) Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology, 220(3): 640-46.
69.
McDannold N, Vykhodtseva N, Hynynen K. (2006) Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys Med Biol, 51:793-807.
70.
Hynynen K, McDannold N, Sheikov NA, Jolesz FA, Vykhodtseva N. (2005) Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage, 24(1): 12-20.
71.
Hynynen K, McDannold N, Vykhodtseva. et al. (2006) Focal disruption of the blood–brain barrier due to 260-kHz ultrasound bursts: a method for molecular imaging and targeted drug delivery. J Neurosurgery, 105: 445-54.
99
72.
Choi JJ, Pernot M, Small SA, Konofagou EE. (2007) Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med Biol, 33:95-104.
73.
Kinoshita M, McDannold N, Jolesz FA, Hynynen K. (2006) Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc Natl Acad Sci USA, 103(31): 11719-23.
74.
Treat LH, McDannold N, Zhang Y, Vykhodtseva N, Hynynen K. (2007) Targeted delivery of doxorubicin to the rat brain at therapeutic levels using MRI-guided focused ultrasound. Int J Cancer, 121:901-907.
75.
Sheikov N, McDannold N, Jolesz F. et al. (2006) Brain arterioles show more active vesicular transport of blood-borne tracer molecules than capillaries and venules after focused ultrasound-evoked opening of the blood-brain barrier. Ultrasound Med Biol, 32:1399-1409.
76.
Raymond SB, Skoch J, Hynynen K, Bacskai BJ. Multiphoton imaging of ultrasound/Optison mediated cerebrovascular effects in vivo. (2007) J Cereb Blood Flow Metab, 27:393-403.
77.
McDannold N, Vykhodtseva N, Hynynen K. (2008) Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med Biol, 34(5): 834-840.
78.
Sheikov N, McDannold N, Vykhodtseva N, Jolesz F, Hynynen K. (2004) Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol, 30:979-989.
79.
Sheikov N, McDannold N, Sharma S, Hynynen K. (2008) Effect of Focused Ultrasound Applied With an Ultrasound Contrast Agent on the Tight Junctional Integrity of the Brain Microvascular Endothelium. Ultrasound Med Biol, 34(7):1093-104.
80.
Raymond SB, Treat LH, Dewey JD, McDannold NJ, Hynynen K, Bacskai BJ. (2008) Ultrasound enhanced delivery of molecular imaging and therapeutic agents in Alzheimer's disease mouse models. PLoS One, 3(5):e2175
100
81.
Deen WM, Lazzara MJ, Myers BD. (2001) Structural determinants of glomerular permeability. Am J Physiol Renal Physiol, 281(4): F579-96.
82.
Daniels BS, Deen WM, Mayer G, Meyer T, Hostetter TH. (1993) Glomerular permeability barrier in the rat. Functional assessment by in vitro methods. J Clin Invest, 92(2): 929-36.
83.
Deen WM, Troy JL, Robertson CR, Brenner BM. (1973) Dynamics of glomerular ultrafiltration in the rat. IV. Determination of the ultrafiltration coefficient. J Clin Invest, 52(6):1500-8.
84.
Chang RL Deen WM, Robertson CR et al. (1976) Permselectivity of the glomerular capillary wall. Studies of experimental glomerulonephritis in the rat using neutral dextran. J Clin Invest, 57(5):1272-86.
85.
Drumond MC, Deen WM. (1994) Structural determinants of glomerular hydraulic permeability. Am J Physiol, 266(1 Pt 2):F1-12.
86.
Chang RL, Deen WM, Robertson CR, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the glomerular capillary wall: III. Restricted transport of polyanions. Kidney Int, 8(4):212-8.
87.
Chang RS, Robertson CR, Deen WM, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the
glomerular
capillary
wall
to
macromolecules.
I.
Theoretical
considerations. Biophys J, 15(9):861-86. 88.
Chang RL, Ueki IF, Troy JL, Deen WM, Robertson CR, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J, 15(9):887-906.
89.
Deen WM. What determines glomerular capillary permeability? (2004) J Clin Invest, 114(10):1412-4.
90.
Blouch K, Deen WM, Fauvel JP, Bialek J, Derby G, Myers BD. (1997) Molecular configuration and glomerular size selectivity in healthy and nephrotic humans. Am J Physiol, 273(3 Pt 2):F430-7.
91.
Daniels BS, Deen WM, Mayer G, Meyer T, Hostetter TH. (1993) Glomerular permeability barrier in the rat. Functional assessment by in vitro methods. J Clin Invest, 92(2):929-36.
101
92.
Bohrer MP, Deen WM, Robertson CR, Troy JL, Brenner BM. (1979) Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. J Gen Physiol, 74(5): 583-93.
93.
Deen WM, Bohrer MP, Brenner BM. (1979) Macromolecule transport across glomerular capillaries: application of pore theory. Kidney Int, 16(3):353-65.
94.
Bennett CM, Glassock RJ, Chang RL, Deen WM, Robertson CR, Brenner BM, Troy JL, ueki IR, Rasmussen B. (1976) Permselectivity of the glomerular capillary wall. Studies of experimental glomerulonephritis in the rat using dextran sulfate. J Clin Invest, 57(5):1287-94.
95.
Chang RS, Robertson CR, Deen WM, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the
glomerular
capillary
wall
to
macromolecules.
I.
Theoretical
considerations. Biophys J, 15(9):861-86. 96.
Chang RL, Ueki IF, Troy JL, Deen WM, Robertson CR, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.Biophys J, 15(9): 887-906.
97.
Rippe C, Rippe A, Torffvit O, Rippe B. (2007) Size and charge selectivity of the glomerular filter in early experimental diabetes in rats. Am J Physiol Renal Physiol ,293(5):F1533-8.
98.
Rippe C, Rippe A, Larsson A, Asgeirsson D, Rippe B. (2006) Nature of glomerular capillary permeability changes following acute renal ischemiareperfusion injury in rats. Am J Physiol Renal Physiol, 291(6):F1362-8.
99.
Chang RL, Deen WM, Robertson CR, Brenner BM. (1975) Permselectivity of the glomerular capillary wall: III. Restricted transport of polyanions. Kidney Int, 8(4):212-8.
100.
Maddox DA, Deen WM, Brenner BM. (1992) Glomerular filtration Hnadbook of physiology. Renal physiology. Bethesda, MD. Am Physiol Soc, Sect. 8, Vol. I, Ch. 13: 545-638.
101.
Blouch K, Deen WM, Fauvel JP, Bialek J, Derby G, Myers BD. (1997) Molecular configuration and glomerular size selectivity in healthy and nephrotic humans.Am J Physiol, 273(3 Pt 2):F430-7.
102
102.
Tryggvason
K.
(1999)
Unraveling
the mechanisms
of
glomerular
ultrafiltration: nephrin, a key component of the slit diaphragm. J Am Soc Nephrol, 10(11):2440-5. 103.
Farquhar MG, Wissig SL, Palade GE. (1961) Glomerular permeability. I. Ferritin transfer across the normal glomerular capillary wall. J Exp Med, 113:47-66.
104.
Farquhar MG, Palade GE. (1961) Glomerular permeability. II. Ferritin transfer across the glomerular capillary wall in nephrotic rats. J Exp Med, 114:699-716.
105.
Caulfield JP, Farquhar MG. ( 1974) The permeability of glomerular capillaries to graded dextrans. Identification of the basement membrane as the primary filtration barrier. J Cell Biol, 63(3):883-903.
106.
Brenner BM, Hostetter TH, Humes HD. (1978) Glomerular permselectivity: barrier function based on discrimination of molecular size and charge. Am J Physiol, 234(6):F455-60.
107.
Kriz W, Kretzler M, Provoost AP, Shirato I. (1996) Stability and leakiness: opposing challenges to the glomerulus. Kidney Int, 49(6):1570-4.
108.
Cochrane SM, Byrne JC, Robinson GB. (1997) The permselectivity of glomerular basement membrane can be compromised by glycation or by exposure to low levels of hypochlorite. Biochim Biophys Acta, 1361(2):21728.
109.
Daniels BS. (1994) Increased albumin permeability in vitro following alterations of glomerular charge is mediated by the cells of the filtration barrier. J Lab Clin Med, 124(2):224-30.
110.
Tay M, Comper WD, Singh AK. (1991) Charge selectivity in kidney ultrafiltration is associated with glomerular uptake of transport probes. Am J Physiol, 260(4 Pt 2):F549-54.
111.
Hamano Y, Grunkemeyer JA, Sudhakar A, Zeisberg M, Cosgrove D, Morello R, Lee B, Sugimoto H, Kalluri R. (2002) Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus. J Biol Chem, 277(34):31154-62.
112.
Huber TB, Schermer B, Benzing T. (2007) Podocin organizes ion channellipid supercomplexes: implications for mechanosensation at the slit diaphragm. Nephron Exp Nephrol, 106(2):e27-31.
103
113.
Friederich C, Endlich N, Kria W, Endlich K. (2006) Podocytes are sensitive to fluid shear stress in vitro. Am J Physiol Renal Physiol, 291(4): F856-65.
114.
Salmon AH, Toma I, Sipos A et al. (2007) Evidence for restriction of fluid and solute movement across the glomerular capillary wall by the subpodocyte space. Am J Physiol Renal Physiol, 293(6):F1777-86.
115.
Spassova MA, Hewavitharana T, Xu W, Soboloff J, Gill DL. (2006) A common mechanism underlies stretch activation and receptor activation of TRPC6 channels. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(44):16586-91.
116.
Neal CR, Muston PR, Njegovan D, Verrill R, Harper SJ, Deen WM, Bates DO. (2007) Glomerular filtration into the subpodocyte space is highly restricted under physiological perfusion conditions. Am J Physiol Renal Physiol, 293(6):F1787-98.
117.
Koriyama Y, Yamada E, Watanabe I. (1992) "Pored-domes" of the fenestrated endotheliocyte of the glomerular and peritubular capillaries in the rodent kidney. J Electron Microsc (Tokyo), 41(1):30-6.
118.
Shirato I. (2002) Podocyte process effacement in vivo. Microsc Res Tech, 57(4):241-6.
119.
Salmon AH, Toma I, Sipos A, Muston PR, Harper SJ, Bates DO, Neal CR, Peti-Peterdi J. (2007) Evidence for restriction of fluid and solute movement across the glomerular capillary wall by the subpodocyte space. Am J Physiol Renal Physiol, 293(6): F1777-86.
120.
Wharram BL, Goyal M, Gillespie PJ, Wiggins JE, Kershaw DB, Holzman LB, Dysko RC, Saunders TL, Samuelson LC, Wiggins RC. (2000) Altered podocyte structure in GLEPP1 (Ptpro)-deficient mice associated with hypertension and low glomerular filtration rate. J Clin Invest, 106(10):128190.
121.
van den Berg JG, van den Bergh Weerman MA, Assmann KJ, Weening JJ, Florquin S. (2004) Podocyte foot process effacement is not correlated with the level of proteinuria in human glomerulopathies. Kidney Int, 66(5):1901-6.
122.
Endlich N, Schordan E, Cohen CD, Kretzler M, Lewko B, Welsch T, Kriz W, Otey CA, Endlich K. (2009) European Renal cDNA Bank Consortium. 104
Palladin is a dynamic actin-associated protein in podocytes. Kidney Int, 75(2):214-26. 123.
Endlich N, Kress KR, Reiser J, Uttenweiler D, Kriz W, Mundel P, Endlich K. (2001) Podocytes respond to mechanical stress in vitro. J Am Soc Nephrol, 12(3):413-22.
124.
Endlich K, Kriz W, Witzgall R. (2001) Update in podocyte biology. Curr Opin Nephrol Hypertens, 10(3):331-40.
125.
Drumond MC, Deen WM. (1994) Stokes flow through a row of cylinders between parallel walls: model for the glomerular slit diaphragm. J Biomech Eng, 116(2):184-9.
126.
Comper WD, Lee AS, Tay M, Adal Y. (1993) Anionic charge concentration of rat kidney glomeruli and glomerular basement membrane. Biochem J, 289 ( Pt 3):647-52.
127.
Robinson GB, Walton HA. Ultrafiltration through basement membrane. In: Renal Basement Membranes in Health and Disease. Price RG és Hudson BG. (szerk): Academic, London. 1987: 147-161.
128.
Laurie GW, Leblond CP, Inoue S, Martin GR, Chung A. (1984) Fine structure of the glomerular basement membrane and immunolocalization of five basement membrane components to the lamina densa (basal lamina) and its extensions in both glomeruli and tubules of the rat kidney. Am J Anat, 169(4):463-81.
129.
Kanwar YS, Farquhar MG. (1979) Anionic sites in the glomerular basement membrane. In vivo and in vitro localization to the laminae rarae by cationic probes. J Cell Biol, 81(1):137-53.
130.
Kanwar YS and Venkatachalam MA. (1992) Ultrastructure of glomerulus and juxtaglomerular apparatus. Handbook of physiology. Renal physiology. Bethesda, MD: Am Physiol Soc, Sect. 8, Vol. I, Ch. 1: 3-40.
131.
Vogel KG. (1994) Glycosaminoglycans and proteoglycanes. Extracellular matrix assembly and structure, Academic. 243-279.
132.
Farquhar MG. (2006) The glomerular basement membrane: not gone, just forgotten. J Clin Invest, 116(8):2090-3.
133.
Shirato I, Tomino Y, Koide H, Sakai T. (1991) Fine structure of the glomerular basement membrane of the rat kidney visualized by highresolution scanning electron microscopy. Cell Tissue Res, 266(1):1-10. 105
134.
Kubosawa H, Kondo Y. (1985) Ultrastructural organization of the glomerular basement membrane as revealed by a deep-etch replica method. Cell Tissue Res, 242(1):33-9
135.
Satchell SC, Braet F. (2009) Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. Am J Physiol Renal Physiol, 296(5):F947-56.
136.
Tryggvason K, Patrakka J, Wartiovaara J. (2006) Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria. N Engl J, 354(13):1387-401.
137.
Sorensson J. (2000) Properties of the endothelial cells and the glomerular barrier (PhD thesis). Gothenburg, Sweden: Gothenburg University.
138.
Rostgaard J, Qvortrup K. (1997) Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvasc Res, 53(1):1-13.
139.
Reeves W, Caulfield JP, Farquhar MG. (1978) Differentiation of epithelial foot processes and filtration slits: sequential appearance of occluding junctions, epithelial polyanion, and slit membranes in developing glomeruli. Lab Invest, 39(2):90-100.
140.
Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. (2003) Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev, 83(1):253-307.
141.
Lehtonen S, Ryan JJ, Kudlicka K, Iino N, Zhou H, Farquhar MG. (2005) Cell junction-associated proteins IQGAP1, MAGI-2, CASK, spectrins, and alphaactinin are components of the nephrin multiprotein complex. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(28):9814-9.
142.
Smithies O. (2003) Why the kidney glomerulus does not clog: a gel permeation/diffusion hypothesis of renal function. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(7):4108-13
143.
Kobori H, Nangaku M, Navar LG, Nishiyama A. (2007) The intrarenal reninangiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease. Pharmacol Rev, 59(3):251-87.
144.
Toma I, Kang JJ, Peti-Peterdi J. (2006) Imaging rennin content and release in the living kidney. Nephron Physiol, 103: p71-75.
145.
Smith S, Anderson S, Ballermann BJ, Brenner BM. (1986) Role of atrial natriuretic peptide in adaptation of sodium excretion with reduced renal mass. 106
J Clin Invest, 77(4):1395-8. 146.
Price DA, Porter LE, Gordon M, Fisher ND, De'Oliveira JM, Laffel LM, Passan DR, Williams GH, Hollenberg NK. (1999) The paradox of the lowrenin state in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 10(11):2382-91.
147.
Gabbai FB. (2001) Effects of nitric oxide synthase blockers on renal function. Nephrol Dial Transplant, 16 Suppl 1:10-3.
148.
Gabbai FB, Blantz RC. (1999) Role of nitric oxide in renal hemodynamics. Semin Nephrol, 19(3):242-50.
149.
Le TH, Coffman TM. (2008) Targeting genes in the renin-angiotensin system. Curr Opin Nephrol Hypertens, 17(1):57-63.
150.
Mayer G, Lafayette RA, Oliver J, Deen WM, Myers BD, Meyer TW. (1993) Effects of angiotensin II receptor blockade on remnant glomerular permselectivity. Kidney Int, 43(2):346-53
151.
Mayer G, Lafayette RA, Oliver J, Deen WM, Myers BD, Meyer TW. (1993) Effects of angiotensin II receptor blockade on remnant glomerular permselectivity. Kidney Int, 43(2):346-53.
152.
Remuzzi A, Perico N, Amuchastegui CS, Malanchini B, Mazerska M, Battaglia C, Bertani T, Remuzzi G. (1993) Short- and long-term effect of angiotensin II receptor blockade in rats with experimental diabetes. J Am Soc Nephrol, 4(1):40-9.
153.
Daniels BS. (1993) The role of the glomerular epithelial cell in the maintenance of the glomerular filtration barrier. Am J Nephrol, 13(5):31823.
154.
Edwards A, Daniels BS, Deen WM. (1997) Hindered transport of macromolecules in isolated glomeruli. II. Convection and pressure effects in basement membrane. Biophys J, 72(1):214-22.
155.
Bolton GR, Deen WM, Daniels BS. (1998) Assessment of the charge selectivity of glomerular basement membrane using Ficoll sulfate. Am J Physiol, 274(5 Pt 2):F889-96.
156.
Oliver JD 3rd, Anderson S, Troy JL, Brenner BM, Deen WH. (1992) Determination of glomerular size-selectivity in the normal rat with Ficoll. J Am Soc Nephrol, 3(2):214-28. 107
157.
Comper WD, Lee AS, Tay M, Adal Y. (1993) Anionic charge concentration of rat kidney glomeruli and glomerular basement membrane. Biochem J, 289 ( Pt 3):647-52.
158.
Comper WD, Tay M, Wells X, Dawes J. (1994) Desulphation of dextran sulphate during kidney ultrafiltration. Biochem J, 297 ( Pt 1):31-4.
159.
Guasch A, Hashimoto H, Sibley RK, Deen WM, Myers BD. (1991) Glomerular dysfunction in nephrotic humans with minimal changes or focal glomerulosclerosis. Am J Physiol, 260(5 Pt 2): F728-37.
160.
Guasch A, Deen WM, Myers BD. (1993) Charge selectivity of the glomerular filtration barrier in healthy and nephrotic humans. J Clin Invest, 92(5):227482.
161.
Comper WD, Haraldsson B, Deen WM. (2008) Resolved: normal glomeruli filter nephrotic levels of albumin. J Am Soc Nephrol, 19(3):427-32.
162.
Burne MJ, Vyas SV, Smit MF, Pratt LM, Comper WD. (1997) Competition between polyanions in glomerular binding and renal clearance.
Arch
Biochem Biophys, 340(2):257-64. 163.
Burne MJ, Adal Y, Cohen N, Panagiotopoulos S, Jerums G, Comper WD. (1998) Anomalous decrease in dextran sulfate clearance in the diabetic rat kidney. Am J Physiol, 274(4 Pt 2):F700-8.
164.
Vyas SV, Burne MJ, Pratt LM, Comper WD. (1996) Glomerular processing of dextran sulfate during transcapillary transport. Arch Biochem Biophys, 332(2):205-12.
165.
Vyas SV, Parker JA, Comper WD. (1995) Uptake of dextran sulphate by glomerular intracellular vesicles during kidney ultrafiltration. Kidney Int, 47(3):945-50.
166.
Mundel P, Schwarz K, Reiser J. (2001) Podocyte biology: a footstep further. Adv Nephrol Necker Hosp, 31:235-41.
167.
Haraldsson B, Nyström J, Deen WM. (2008) Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol Rev, 88(2):451-87.
168.
Lazzara MJ, Deen WM. (2001) Effects of plasma proteins on sieving of tracer macromolecules in glomerular basement membrane. Am J Physiol Renal Physiol, 281(5):F860-8.
108
169.
Farquhar MG. (1975) The primary glomerular filtration barrier--basement membrane or epithelial slits? Kidney Int, 8(4):197-211.
170.
Reiser J, Kriz W, Kretzler M, Mundel P. (2000) The glomerular slit diaphragm is a modified adherens junction. J Am Soc Nephrol, 11(1):1-8.
171.
van den Berg JG, van den Bergh Weerman MA, Assmann KJ, Weening JJ, Florquin S. (2004) Podocyte foot process effacement is not correlated with the level of proteinuria in human glomerulopathies. Kidney Int, 66(5):1901-6.
172.
Daniels BS, Hauser EB, Deen WM, Hostetter TH. (1992) Glomerular basement membrane: in vitro studies of water and protein permeability. Am J Physiol, 262(6 Pt 2):F919-26.
173.
Kanwar YS, Farquhar MG. (1979) Isolation of glycosaminoglycans (heparan sulfate) from glomerular basement membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4493-7.
174.
Martini S, Kretzler M. (2009) How to build a tight but permeable glomerular junction. J Am Soc Nephrol, 20(7):1420-1.
175.
Daniels BS, Hauser EB, Deen WM, Hostetter TH. (1992) Glomerular basement membrane: in vitro studies of water and protein permeability. Am J Physiol, 262(6 Pt 2):F919-26.
176.
Walton HA, Byrne J, Robinson GB. (1992) Studies of the permeation properties of glomerular basement membrane: cross-linking renders glomerular basement membrane permeable to protein. Biochim Biophys Acta, 1138(3):173-83.
177.
Ronco P. (2007) Proteinuria: is it all in the foot? J Clin Invest, 117(8):207982.
178.
Kalluri R. (2006) Proteinuria with and without renal glomerular podocyte effacement. J Am Soc Nephrol, 17(9):2383-9.
179.
Sever S, Altintas MM, Nankoe SR, Möller CC, Ko D, Wei C, Henderson J, del Re EC, Hsing L, Erickson A, Cohen CD, Kretzler M, Kerjaschki D, Rudensky A, Nikolic B, Reiser J. (2007) Proteolytic processing of dynamin by cytoplasmic cathepsin L is a mechanism for proteinuric kidney disease. J Clin Invest, 117(8):2095-104.
180.
Ronco P. (2007) Proteinuria: is it all in the foot? J Clin Invest, 117(8):207982. 109
181.
Farquhar MG. (2006) The glomerular basement membrane: not gone, just forgotten. J Clin Invest, 116(8):2090-3.
182.
Jarad G, Cunningham J, Shaw AS, Miner JH. (2006) Proteinuria precedes podocyte abnormalities inLamb2-/- mice, implicating the glomerular basement membrane as an albumin barrier. J Clin Invest, 116(8):2272-9.
183.
Haraldsson B, Nyström J, Deen WM. (2008) Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol Rev, 88(2):451-87.
184.
Drumond MC, Kristal B, Myers BD, Deen WM. (1994) Structural basis for reduced glomerular filtration capacity in nephrotic humans. J Clin Invest, 94(3):1187-95.
185.
Deen WM, Maddox DA, Robertson CR, Brenner BM. (1974) Dynamics of glomerular ultrafiltration in the rat. VII. Response to reduced renal mass. Am J Physiol, 227(3):556-62.
186.
Squarer A, Lemley KV, Ambalavanan S et al. (1998) Mechanisms of progressive glomerular injury in membranous nephropathy. J Am Soc Nephrol, 9(8):1389-98.
187.
Fogo AB. (2007) Mechanisms of progression of chronic kidney disease. Pediatr Nephrol, 22(12):2011-22.
188.
Pagtalunan ME, Miller PL, Jumping-Eagle S et al. (1997) Podocyte loss and progressive glomerular injury in type II diabetes. J Clin Invest, 99(2): 342-8.
189.
Levy J, Morgan J, Brown E. Oxford Handbook of Dialysis. (2005) 2nd ed. New York, Oxford University Press. 304.
190.
Daugharty TM, Brenner BM. (1975) Reversible hemodynamic defect in glomerular filtration rate after ischemic injury. Am J Physiol, 228(5):1436-9.
191.
Andersson M, Nilsson U, Hjalmarsson C, Haraldsson B, Nyström JS. (2007) Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. Am J Physiol Renal Physiol, 292(6): F1802-9.
192.
Meyers CM, Geanacopoulos M, Holzman LB, Salant DJ. (2005) Glomerular disease workshop. J Am Soc Nephrol, 16(12):3472-6.
193.
Quaggin SE. (2007) Sizing up sialic acid in glomerular disease. J Clin Invest, 117(6):1480-3.
110
194.
Rippe C, Rippe A, Torffvit O, Rippe B. (2007) Size and charge selectivity of the glomerular filter in early experimental diabetes in rats. Am J Physiol Renal Physiol, 293(5):F1533-8.
195.
Cochrane SM, Robinson GB. (1995) In vitro glycation of glomerular basement membrane alters its permeability: a possible mechanism in diabetic complications. FEBS Lett, 375(1-2):41-4.
196.
Branten AJ, van den Born J, Jansen JL, Assmann KJ, Wetzels JF. (2001) Familial nephropathy differing from minimal change nephropathy and focal glomerulosclerosis. Kidney Int, 59(2):693-701.
197.
Yu Y, Leng CG, Kato Y, Ohno S. (1997) Ultrastructural study of glomerular capillary loops at different perfusion pressures as revealed by quick-freezing, freeze-substitution and conventional fixation methods. Nephron, 76(4):4529.
198.
Little MH. (2006) Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol, 17(9):2390-401.
199.
Schieppati A, Remuzzi G. (2003) The June 2003 Barry M. Brenner Comgan lecture. The future of renoprotection: frustration and promises. Kidney Int, 64(6):1947-55.
200.
Edwards A, Daniels BS, Deen WM. (1997) Hindered transport of macromolecules in isolated glomeruli. II. Convection and pressure effects in basement membrane. Biophys J, 72(1):214-22.
201.
White JA, Deen WM. (2002) Agarose-dextran gels as synthetic analogs of glomerular basement membrane: water permeability. Biophys J, 82(4):20819.
202.
Lumsden JH, Muller K. (1978) On establishing refernce values. Can J Comp Med, 42(3):293-301.
203.
Reusch B, Murray JK, Papasonoullotis K, Redrobe SP. (2009) Urinary protein: creatinine ratio in rabbits in relation to their serological status to Encephalitozon cuniculi. Vet. Rec, 164(10):293-5.
111
12. ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Fischer K, McDannold NJ, Kardos M, Szabo Ant, Szabo And, Reusz GS, Jolesz F. (2009) Renal ultrafiltration changes induced by focused ultrasound. Radiology, 253(3):697-705. (IF: 5,996) Fischer K, Gedroyc W, Jolesz F. (2010) Focused ultrasound as a local therapy for liver cancer. Cancer J, in press (IF: 2,769) Fischer K, Galamb O, Molnar B, Tulassay Zs, Szabo A. (2007) RNA expression as a prognostic tool in idiopathic nephrotic syndrome. Orv.Hetil, 10;148(23):1067-75. Fischer K, McDannold N, Kardos M, Szabo Ant, Szabo And, Reusz GS, Jolesz F. Power dependent effects of focused ultrasound on the glomerular ultrafiltration. In submission.
Yoo SS, Lee JH, Jung KI, Zhang Z, Fischer K, Min BK, McDannold NJ, PascualLeone A, Jolesz FA, Bystritsky A. (2010) Image-guided Focused Ultrasound Stimulation of Somatomotor Area: Preliminary Study. NeuroReport, Submitted (IF: 1,904)
112
13. ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉTŐL FÜGGETLEN, MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
Lee W, Lee V, Polio S, Keegan P, Lee JH, Fischer K, Park JK, Yoo SS. (2009) Ondemand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnol Bioeng, 105(6):1178-86. (IF: 2,936) Mácsai E, Cseh Á, Budai G, Mészáros G, Vásárhelyi B, Fischer K, Szabó A, Treszl A. (2009) Effect of 3-month doxazosin therapy on T-cell subsets in type 2 diabetic patients. J Int Med Res, 37: 1982-87. (IF: 0,75) Lee W, Debasitis JC, Lee VK, Lee JH, Fischer K, Edminster K, Park JK, Yoo SS. (2009) Multi-layered cultured of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication. Biomaterials, 30(8): 1587-95. (IF: 6,262)
Lee W, Pinckney J, Lee V, Lee JH, Fischer K, Polio S, Park JK, Yoo SS. (2009) Three-dimensional bioprinting of rat embryonic neural cells. Neuroreport, 20(8):798803. (IF: 2,163) Marzelli M, Fischer K, Kim YB, Mulkern RV, Yoo SS, Park HW, Cho ZH. (2008) Composite MR Contrast Agents for Conditional Cell-Labeling. Int J Imag Syst Technol, 18: 79–84. (IF: 0,703) Galamb O, Sipos F, Fischer K, Tulassay Z, Molnar B. (2005) The results of the expression array studies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorectal cancer. Cytometry B Clin Cytom, 68(1): 1-17. (IF: 2,843)
113
14. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani Tulassay Tivadar Professzor Úrnak, hogy az általa vezetett PhD program résztvevője lehettem az I. Sz. Gyermekklinika nefrológiai kutatólaboratóriumában. Ez a laboratórium biztosította számomra azt a tudományos környezetet, ahol elsajátíthattam a korszerű kutatási módszertan alapjait. Témavezetőim, Professzor Szabó András és Professzor Reusz György irányítása alatt kezdtem meg munkámat az I. Sz Gyermekklinikán. Bevontak az Intézetben már folyó tudományos témákba, illetve önálló kutatási feladatokkal láttak el. Köszönöm nekik, hogy munkám során támogatásukra, segítségükre és bátorításukra bármikor számíthattam. Köszönetet szeretnék mondani Jolesz Ferenc Professzor Úrnak, akinek a jóvoltából PhD munkám második felét az Egyesült Államokban, a Focused Ultrasound Laboratory, Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School-ban végezhettem. Hálás vagyok Jolesz Professzor Úr töretlen támogatásáért, tanácsaiért, és a belém vetett bizalmáért. Megtiszteltetés számomra, hogy az általa létrehozott laboratóriumban dolgozhattam, tanúja lehettem munkájának és elképzeléseinek megvalósításának. Szeretném megköszönni Joseph V. Bonventre Professzor Úr segítségét, a kérdéseimre adott hasznos válaszait, amelyek mindig átsegítettek az átmeneti nehézségeken. Köszönetet szeretnék mondani Szabó Antal Professzor Úrnak és a Kémiai laboratórium munkatársainak, Nyári Tündének és Molnárné S. Ritának a laboratóriumi mérésekben nyújtott elengedhetetlen segítséért. Köszönetet
szeretnék
mondani
munkatársaimnak,
mind
az
I.
Sz
Gyermekklinika veselaboratóriumából, Dr. Vannay Ádám, Dr. Rusai Krisztina, Dr. Treszl András és Bernáth Mária, mind pedig a Fókuszált Ultrahang Laboratóriumból, elsősorban Dr. Nathan McDannold, Dr. Yongzhi Zhang és Dr. Lisa Treat, a kisérletekben való munkájukért és barátságukért. Szeretném ezt a dolgozatot a családomnak adni, szüleimnek, Fischer Évának és Fischer Herbertnek, nagymamámnak, Lendvai Bélánénak, férjemnek, Dr. Erdős Ákosnak, két kisfiúnknak, Zebulonnak és Zakariásnak, akik szeretete, türelme és támogatása a legnagyobb érték számomra. 114
115
