29
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik isolat bakteri dari ikan tuna dan cakalang 4.1.1 Morfologi isolat bakteri Secara alamiah, mikroba terdapat dalam bentuk campuran dari berbagai jenis. Untuk mempelajari sifat-sifat pertumbuhan, morfologi dan sifat fisiologis mikroba, maka masing-masing mikroba tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga terbentuk kultur murni yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel satu spesies atau satu galur mikroba (Pelczar dan Chan 2006). Tahap isolasi pada cawan petri bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri yang diinginkan. Setelah dilakukan proses isolasi bakteri dari ikan tuna serta ikan cakalang, selanjutnya dilakukan inkubasi selama 24 jam untuk menumbuhkan bakteri yang telah diisolasi sebelumnya. Tabel 4 menunjukkan karakteristik hasil isolasi bakteri dari kelima jenis ikan tersebut. Tabel 4. Karakterisasi isolat bakteri ikan tuna dan cakalang Jenis ikan
Kode
Bluefin tuna
Bf 1 Bf 2 Bf 3 Bf 4 Bf 5 Alb 1 Alb 2 Alb 3 Alb 4 Alb 5 Alb 6 Alb 7 Be 1 Be 2 Be 3 Be 4 Yf 1 Yf 2 Yf 3 Yf 4 Ck 1 Ck 2
Albacore
Bigeye tuna
Yellowfin tuna
Cakalang
Bentuk permukaan Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Datar Datar Cembung Cembung Cembung Datar Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung
Bentuk tepian Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin Licin
Bentuk koloni
Warna
Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Bulat Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Tidak beraturan Bulat Bulat
Merah Kuning Merah Putih Krem Kuning Oranye Merah Merah Kuning Hitam Krem Krem Krem Krem Krem Merah Merah Kuning Krem Putih Putih
30
Koloni bakteri yang terpisah (koloni tunggal) dari daging ikan tuna dan cakalang digunakan pada tahap penelitian selanjutnya yaitu pewarnaan gram dan karakterisasi gen hdc pengkode enzim histidin dekarboksilase yang berpotensi menghasilkan histamin . Berdasarkan Tabel 4, morfologi koloni dari bakteri yang diisolasi dari daging ikan tuna dan cakalang memiliki bentuk permukaan sama, yaitu cembung kecuali pada sampel Alb 1, 2 dan 6 yang memiliki bentuk permukaan datar. Koloni bakteri yang diisolasi bentuk tepiannya licin, bentuk elevasi koloninya bulat dan tidak beraturan. Koloni bakteri yang diperoleh memiliki warna koloni merah, kuning, putih, krem, oranye dan hitam. Isolasi bakteri dilakukan sebanyak dua kali pengisolasian sampai dihasilkan isolat yang murni. Setiap isolat murni yang diperoleh dikultur pada agar miring. Tahap selanjutnya adalah pengamatan morfologi sel yang meliputi pewarnaan gram. 4.1.2 Karakterisasi isolat bakteri Setelah didapatkan isolat murni dari bakteri yang diisolasi pada tahap sebelumnya, maka tahap selanjutnya adalah proses pewarnaan gram yang bertujuan untuk mengetahui bentuk sel secara mikroskopik. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi diberi berbagai macam larutan seperti ungu kristal (UK), larutan yodium (lugol), alkohol dan pewarna tandingan, yaitu safranin. Bakteri yang tergolong kedalam gram positif akan mempertahankan zat pewarna ungu kristal sehingga tetap berwarna ungu ketika dilihat secara mikroskopik. Sedangkan bakteri yang tergolong kedalam gram negatif kehilangan zat pewarna ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol sehingga terlihat berwarna merah setelah ditambahkan pewarna safranin. Tabel 5 menunjukkam hasil pewarnaan gram terhadap bakteri yang diisolasi dari ikan bluefin tuna, albacore, bigeye tuna dan yellowfin tuna serta ikan cakalang.
31
Tabel 5. Hasil pewarnaan gram bakteri dari isolat ikan tuna dan cakalang Jenis ikan Bluefin tuna
Albacore
Bigeye tuna
Yellowfin tuna
Cakalang
Kode Bf 1 Bf 2 Bf 3 Bf 4 BF 5 Alb 1 Alb 2 Alb 3 Alb 4 Alb 5 Alb 6 Alb 7 Be 1 Be 2 Be 3 Be 4 Yf 2 Yf 2 YF 3 Yf 4 Ck 1 Ck 2
Warna Merah Merah Merah Merah Merah Merah Ungu Merah Merah Merah Merah Merah Ungu Merah Merah Merah Ungu Merah Merah Ungu Merah Merah
Bentuk Bulat Bulat Batang Batang Batang Bulat Bulat Batang Batang Batang Batang Batang Koma Koma Batang Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Batang Koma
Gram Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Positif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Positif Negatif Negatif Negatif Positif Negatif Negatif Positif Negatif Negatif
Berdasarkan Tabel 5 dapat diketahui bahwa isolat bakteri yang diperoleh didominasi oleh bakteri gram negatif, yaitu sebanyak 18 isolat. Bakteri gram positif diperoleh sebanyak 4 isolat, yaitu Alb 2; Be 1; Yf 1 dan Yf 4. Bakteri gram negatif mengandung lipid dan peptidoglikan yang lebih tipis dibandingkan bakteri gram positif. Faktor inilah yang menyebabkan terjadinya perbedaan warna dari kedua jenis bakteri tersebut. Penambahan ungu kristal (UK) dan lugol (Yodium) saat pewarnaan gram berlangsung menyebabkan terbentuknya kompleks UK-Y di dalam sel-sel bakteri sehingga sel tetap berwarna ungu (Pelczar dan Chan 2006). Bentuk koloni yang diperoleh adalah bulat, batang dan koma (spiral). Berikut ini adalah Gambar hasil pewarnaan gram terhadap isolat bakteri yang diperoleh dari sampel yang digunakan yaitu dari empat jenis ikan tuna (kode: Bf, Alb, Be dan Yf ) dan cakalang (Ck).
32
Bf 1
Bf 2
Bf 3
Bf 4
Bf 5
Gambar 15.1 : Bentuk sel bakteri secara mikroskopik hasil pewarnaan gram dari isolat bakteri ikan bluefin tuna
Alb 1
Alb 2
Alb 3
Alb 4
Alb 5
Alb 6 Alb 7 Gambar 15.2: Bentuk sel bakteri secara mikroskopik hasil pewarnaan gram dari isolat bakteri ikan albacore
Be 1
Be 2
Be 3
Be 4
Gambar 15.3: Bentuk sel bakteri secara mikroskopik hasil pewarnaan gram dari isolat bakteri ikan bigeye tuna
Yf 1
Yf 2
Yf 3
Yf 4
Gambar 15.4: Bentuk sel bakteri secara mikroskopik hasil pewarnaan gram dari isolat bakteri ikan yellowfin tuna
33
Ck 1
Ck 2
Gambar 15.5: Bentuk sel bakteri secara mikroskopik hasil pewarnaan gram dari isolat bakteri ikan cakalang 4.2 Ekstrak DNA Bakteri Setiap nukleotida disusun oleh basa nitrogen, gula deoksiribosa dan pospat. Deoxyribonucleic Acid (DNA) menyusun gen yang menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang terkandung dalam suatu organisme termasuk bakteri dapat diketahui dengan melakukan ekstraksi DNA. Ekstrak DNA bakteri yang diperoleh akan menentukan protein suatu bakteri melalui susunan basa nitrogennya (Yuwono 2006). Ekstrak DNA diperoleh dari bakteri yang diisolasi dari daging ikan tuna dan cakalang. Isolat bakteri yang diperoleh berjumlah 22 isolat yang berasal dari empat jenis ikan tuna (Bluefin tuna, Albacore, Bigeye tuna dan Yellowfin tuna) serta cakalang. Masing-masing karakteristik dan bentuk sel secara mikroskopik dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5. Ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan menggunakan metode Cetyl-trimethyl-amonium bromide (CTAB) 10% dengan menambahkan SDS, lysozim dan EDTA. Cetyl-Trimethyl-Amonium Bromide (CTAB) bertindak sebagai deterjen yang dapat melarutkan membran bakteri sehingga dapat membantu proses ekstraksi DNA bakteri target. Penambahan Sodium Dodesil Sulfat (SDS) menyebabkan protein yang menyusun tubuh bakteri akan mengalami denaturasi. Ekstrak DNA bakteri yang diperoleh diharapkan bersih dari berbagai pengotor seperti protein dan lemak karena akan mempengaruhi kemurnian dari ekstrak DNA bakteri yang diperoleh. Kualitas dan kuantitas DNA dapat diketahui melalui alat yang disebut dengan spektrofotometer. Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan (Sulandari dan Zein 2003). Penentuan tingkat kemurnian DNA perlu dilakukan sebelum proses amplifikasi dengan metode PCR, sehingga sampel yang diamplifikasi secara enzimatik berdasarkan metode PCR tersebut
34
telah mengandung DNA pada konsentrasi tertentu. Konsentrasi DNA sampel diukur dengan 2 kali ulangan menggunakan spektrofotometer. Hasil pengukuran tingkat kemurnian DNA sampel dapat dillihat pada Tabel 6. Tabel 6. Konsentrasi DNA sampel yang diukur menggunakan spektrofotometer Kode sampel
Rasio
Bf 1 Bf 2 Bf 3 Bf 4 Bf 5 Alb 1 Alb 2 Alb 3 Alb 4 Alb 5 Alb 6 Alb 7 Be 1 Be 2 Be 3 Be 4 Yf 1 Yf 2 Yf 3 Yf 4 Ck 1 Ck 2
2,156 2,016 2,288 1,843 1,678 1,705 1,136 2,005 2,035 1,782 1,944 2,274 1,799 2,217 2,004 2,235 1,805 1,752 2,007 2,054 1,825 2,602
Konsentrasi DNA (µg/ml) 200 3765 10 3935 15 0 0 2065 115 445 2510 250 0 125 680 445 0 0 0 2175 235 70
Berdasarkan Tabel 6 bahwa sampel yang memiliki tingkat kemurnian yang DNA yang tinggi adalah Bf 2 dan 4; Alb 3,4 dan 6; Be 3; Yf 4 dan Ck 1. Hal ini dibuktikan dengan nilai rasio masing-masing sampel berkisar antara 1,8-2,0 serta konsentrasi DNA yang cukup tinggi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Muladno (2002) bahwa molekul DNA dikatakan murni apabila rasio antara nilai OD260 dan OD280 berkisar antara 1,8-2,0. Sampel yang memiliki nilai rasio lebih kecil dari 1,8 atau lebih besar dari 2,0 belum memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Hal tersebut disebabkan oleh rendahnya konsentrasi DNA bakteri yang diperoleh pada saat ekstraksi. Selain itu dapat disebabkan oleh proses ekstraksi DNA bakteri yang belum murni karena masih dikontaminasi oleh berbagai pengotor seperti RNA dan
35
protein. Perhitungan konsentrasi DNA genom sampel dapat dilihat pada Lampiran 3. Sampel yang diperoleh dengan tingkat kemurnian DNA yang tinggi selanjutnya diamplifikasi untuk melipatgandakan basa nukleotidanya melalui reaksi enzimatik dengan metode PCR. 4.3 Amplifikasi fragmen DNA bakteri melalui metode PCR Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai PCR merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro (Fatchiyah 2006). Metode PCR merupakan salah satu teknik yang digunakan secara luas dalam biologi molekuler (Yuwono 2006). Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Dengan demikian, pada tahap akhir proses PCR diperoleh jumlah fragmen (potongan) DNA sebanyak 2n dari jumlah semula dimana n adalah jumlah reaksi dalam proses PCR. Hasil elektroforegram sampel Bf 4 dan Be 3 (Gambar 16) menunjukkan pita yang telah sesuai dengan panjang get target yaitu 709 bp (Takahashi et al. 2003). 1 2
3
4 5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
19 20
1000 bp 700 bp 600 bp 500 bp
Gambar 16. Elektroforegram produk PCR dengan menggunakan primer Histidin dekarboksilase (Hdc) Keterangan: 1. Bf 1 2. Bf 4 3. Bf 3 4. Be 3
5. Alb 3 6. Alb 4 7. Alb 5 8. Alb 6
9. Yf 1 10. Be 4 11. Yf 2 12. Yf 3
13. Alb 1 14. Alb 2 15. Be 1 16. Be 2
17. Bf 5 18. Alb 7 19. K. negatif 20. Marker
36
Sementara sebanyak 20 sampel dari 22 total sampel tidak menunjukkan adanya pita yang menandakan adanya DNA bakteri target yang terlihat pada saat visualisasi dibawah sinar UV. Hal ini menunjukkan bahwa sampel tersebut tidak memiliki gen hdc sebagai pengkode enzim histidin dekarboksilase. 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11
12
13
14
15
16
17
1000 bp 500 bp
Gambar 17. 1: Elektroforegram produk PCR dengan menggunakan primer 106 dan 107 Keterangan: 1. Bf 1 2. Bf 2 3. Bf 3 4. Bf 4 1
2
3
5. Bf 5 6. Be 1 7. Yf 4 8. Yf 2 4
5
9. Yf 3 10. Ck 1 11. Ck 2 12. Alb 1 6
7
8
13. Alb 3 17. Marker 14. Alb 4 15. Alb 6 16. K. Negatif 9
10
11 12
13
14
15
16 17
1000 bp 500 bp
Gambar 17. 2: Elektroforegram produk PCR dengan menggunakan primer 106 dan 107 Keterangan: 1. Bf 1 2. Bf 2 3. Bf 3 4. Alb 1 5. Alb 2
6. Alb 3 7. Bf 4 8. Bf 5 9. Be 3 10. Yf 1
11. Yf 2 12. Yf 3 13. Yf 4 14. Be 1 15. Be 2
16. K.negatif 17. Marker
37
Sebanyak 3 sampel dari total isolat (22 sampel) pada media agarosa dengan menggunakan primer 106 dan 107 menunjukkan adanya pita pada agarosa ketika dilihat di bawah sinar UV. Ketiga sampel tersebut memiliki panjang basa 534 base pairs yang telah sesuai dengan literatur (Takahashi et al. 2003). Sampel tersebut merupakan DNA bakteri yang diisolasi dari ikan tuna jenis bluefin tuna, yellowfin dan bigeye tuna dengan kode sampel masing-masing adalah Bf 4, Yf 4, dan Be 3. Hasil visualisasi DNA bakteri target terhadap sampel BF 4 dan Yf 4 dapat dilihat pada Gambar 17.1. Hasil visualisasi pada gel agarosa untuk sampel Be 3 dapat dilihat pada Gambar 17.2. 4.4 DNA Sequencing Proses sequencing atau penerjemahan urutan basa nukleotida terhadap DNA bakteri target hanya dilakukan untuk sampel yang telah berhasil diisolasi gen hdcnya. Proses sequencing hanya dilakukan terhadap sampel yang menggunakan primer 106 dan 107, sedangkan untuk sampel yang menggunakan primer histidin dekarboksilase (Hdc) tidak dilakukan proses sequencing karena semua sampel tersebut tidak bisa dipurifikasi sebagai langkah awal untuk sequencing. Hasil Basic Local Asignment Search Tool (BLAST) menunjukkan jenis bakteri yang diperoleh telah sesuai dengan ciri-ciri bakteri yang telah berhasil diisolasi pada tahap sebelumnya. Jenis bakteri yang diperoleh berdasarkan hasil BLAST dengan menggunakan primer 106 dan 107 pada sampel Be 3 adalah gen hdc dari bakteri Morganella morganii strain 25a32 berdasarkan data dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) yang berstandar internasional. Sampel Be 3 merupakan jenis bakteri gram negatif berbentuk batang.
