10/16/2013
Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian
TEKNIK FUSI SEL: Isolasi Protoplasma Fusi protoplasma
Protoplasma • Sel tanpa dinding sel • Dapat digunakan sebagai eksplan • Digunakan untuk rekayasa genetika – Paling sering untuk ekspresi transien – transformasi konifer
• Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik
Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini? • Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan • Mengatasi tanaman yang incompatibilitas • Dimungkinkan untuk persilangan secara luas • Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas • Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini • Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .
1
10/16/2013
Terminologi dalam teknik fusi sel • Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg berbeda jenisnya • Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel protoplasma • Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih
Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual : Hibrida Somatik
Hibrida Seksual
1.Mempunyai organel dr kedua sel tetua yang bersatu dalam satu sel
Berisi organel yang berasal dari tetua betina
2.Hasil fusi terdapat genom inti dari kedua sel tetua
Genom ½ berasal dr tetua betina dan ½ dari tetua jantan
3. Menghasilkan tan ploidi 2 X lipat
Ploidi sama dengan tetuanya
Hibridisasi somatik
2
10/16/2013
Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas Empat tahap untuk produksi hibrida: • Isolasi Protoplas • FusiProtoplas • Seleksi Hibrida • Regenerasi tanaman
1.
2.
3. 4. 5.
Tahapan Fusi Protoplas Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat Seleksi heterokarion setelah fusi Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi genetik dari tanaman yang dihasilkan
Persyaratan fusi : Carlson et al. (1972), Power et al. (1975) – persyaratan tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan protoplas 2 (dua) dua donor spesies Ahli lain – menggunakan senyawa kimia untuk menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan protoplas tetua Metode seleksi : Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi secara visual (defisiensi klorofil)
3
10/16/2013
Metode Fusi Protoplas : 1. Pemilihan protoplas tetua 2. Induksi fusi secara kimia 3. Fusi secara elektrik 4. Praktek elektrofusi 5. Mikrofusi
Isolasi Protoplas secara enzimatik • Daun: lapisan epidermis dibuang • Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum) – Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan – Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L
• Tambahkan enzim – Selulase, hemiselulase, pektinase – Terjadi degradasi dinding sel • Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi • Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel
1. Protoplas Tetua • Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau kultur suspensi sel umur 3-5 hari • Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas regenerasi lebih baik • Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase (untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran dinding sel) • Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik
Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma •20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya •Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish • Inkubasikan 28o C 6 jam, saring dg saringan 50-100 μm •Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg menambahkan 5ml washing medium melalui filter •Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit •Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit •Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi •Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml •Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab •Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah 7-10 hari
4
10/16/2013
Media kultur protoplasma • Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya • Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol 500-600 mM/L • Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan pembelahan sel • ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi • Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA • Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P
2. Induksi Fusi secara Kimiawi • Membran protoplas bermuatan negatif dan protoplas menjadi saling tolak menolak berdekatan mengubah pH medium dg polikation atau efek dehidrasi • PEG – menyebabkan aglutinasi (penggumpalan), tergantung suhu medium, BM PEG, konsentrasi dan lama perlakuan PEG • Galur sel mempengaruhi optimasi fusi. Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi dibandingkan dg bervakuola besar
Hasil isolasi protoplasma
Protoplas ma dalam larutan
Daun plantlet kentang sbg sumber protoplasma
FUSI PROTOPLAS: • Tidak terjadi secara spontan • Selain bisa diinduksi dengan menambah promotor fusi berupa senyawa kimia PEG, juga bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus • Tiga kemungkinan produk hasil fusi: – Sel A=Sel A – Sel B=Sel B – Sel A=Sel B
• Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)
5
10/16/2013
Sel A
Tambahkan Enzim
Sel B
Tambah Promotor Fusi
PROTOPLASMA DILIHAT DI BAWAH MIKROSKOP
HASIL FUSI PROTOPLASMA
6
10/16/2013
Seleksi dan kultur heterokarion 1. Penanda yang dapat dilihat Misal : fluorochrome – klorofil berwarna merah (mesofil) fluorescein diaceate – kloroplas hijau kekuningan (kloroplas) 2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih sel yang diaktifkan dengan fluoresen) 3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai sumber nitrogen planlet yang tumbuh sebagai hibrid 4. Kultur heterokarion sangat tergantung materi yang difusikan
Regenerasi Protoplasma menjadi plantlet •Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur • Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri • Tekanan osmose media
perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol
• Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel
• Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom • Menghasilkan tanaman bebas patogen KULTUR PROTOPLASMA UNTUK MERAKIT TANAMAN HIBRIDA
Regenerasi protoplasma menjadi plantlet bersifat hibrida
Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik
Wortel X Aegopdium
Kedelai X Alfalfa
Wortel X Barlei
Kedelai X Barlei
Wortel X Petunia
Kedelai X Jagung
Wortel X Tembakau
Kedelai X Meadow Saffron
Jagung X Oat
Kedelai X Pea
Jagung X Sorghum
Kedelai X Tembakau
Petunia X Fava Bean
Kedelai X Rape
Petunia X Parthenocissus
Tomat X Kentang
7
10/16/2013
Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik
Dacus carota
X D. capillifplius
Datura innoxia
X D. discolor
Datura innoxia
X D. stramonium
Nicotiana glauca
X N. langsdorffii
Nicotiana sylvertris X N. knightiana Nicotiana tabacum X N. debneyi Nicotiana tabacum X N. sylvestris Petunia hybrida
LATIHAN • Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi protoplas, variasi somaklonal, kultur heterokarion! • Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya! • Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion! • Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada hibridisasi somatik! • Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah kromosom? • Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual, hibridisasi somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar!
X P. parodii
8