!HU000007713T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 713
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 03025512 2003. 11. 06.
(73) Jogosult: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, 65929 Frankfurt am Main (DE)
EP
(72) Feltalálók: ZEIHER, Andreas, 60594 Frankfurt am Main (DE); DIMMELER, Stefanie, 60594 Frankfurt am Main (DE); HEESCHEN, Christopher, 81247 München (DE); RUETTEN, Hartmut, 65510 Idstein (DE) (54)
HU 007 713 T2
A61K 31/167
(21) Magyar ügyszám: E 04 818113 (22) A bejelentés napja: 2004. 10. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040818113 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1682111 A1 2005. 05. 19. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1682111 B1 2010. 01. 06.
(2006.01) A61P 9/10 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05044249 PCT/EP 04/011944
(74) Képviselõ: dr. Molnár István, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
eNOS transzkripció-fokozók ischémiás szívbetegségek sejtterápiájában történõ alkalmazásra
A leírás terjedelme 14 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 713 T2
A találmány tárgyát képezi olyan vegyületek alkalmazása, amely fokozza az endothelialis nitrogén-oxidszintáz (eNOS) transzkripcióját õs¹ vagy szülõi sejtek kezelésére olyan páciensek sejtterápiájában, akik ischaemiás szívbetegségekben, így például szívkoszorú-betegségben vagy ischaemiás kardiomiopátiában szenvednek. Az ilyen, például csontvelõbõl izolálható sejtek kezelése eNOS-transzkripció-fokozóval azok beadása elõtt javítja azok funkcionális aktivitását és javítja a szív neovaszkularizációját és a szívizom-regenerációt. Az infarktus utáni szívroham továbbra is a morbiditás és mortalitás fõ oka azon betegekben, akik ischaemiás szívbetegségben, így például szívkoszorú-betegségben vagy ischaemiás kardiomiopátiában szenvednek. Bár az elzárt artéria gyors reperfúziója jelentõsen csökkentette a korai mortalitás elõfordulási arányait, ventrikuláris (kamrai) átalakulási folyamatok, amelyek jellemzõje az infarktusos terület progresszív kiterjedése és a bal kamrai üreg dilatációja, gyakran vezet szívroham kifejlõdéséhez egy akut szívinfarktust már túlélõ betegekben. A fordított átalakulás fõ célja a neurovaszkularizáció serkentése lenne, továbbá a szívizom-miociták regenerálódásának fokozása az infarktusos területen. Az újabb kutatási eredmények megállapították az endothelialis õs¹ és szülõi sejtek alapvetõ szerepét a posztnatális neovaszkularizációban és szívregenerálódásban. Egy kritikus ischaemia utáni neovaszkularizáció fokozása egy fontos terápiás lehetõség olyan események után, mint amilyen például a szívinfarktus vagy a végtagi ischaemia. Napjainkig úgy gondolták, hogy a felnõtt emberben az ischaemiás szövet neovaszkularizációja az érett endothelialis sejtek migrációjára és proliferációjára korlátozódik, ez az angiogenezisnek nevezett folyamat. Ugyanakkor növekvõ mennyiségû bizonyíték utal arra, hogy cirkuláló endothelialis szülõi sejtek (EPC¹k) elhelyezkednek az ischaemia helyein és hozzájárulnak új véredények képzõdéséhez (C. Kalka és munkatársai, Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells far therapeutic neovascularization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:3422–7). Primitív endothelialis szülõi sejtekbõl (angioblasztok) származó véredények embrionális fejlõdésével analóg módon ezt a folyamatot vaszkulogenezisnek hívják. A keringõ szülõi sejtek fontosságát az a tény is bizonyítja, hogy azok gyülekezésének gátlása gátolja a daganat angiogenezisét. Az EPC¹k mobilizálhatók a csontvelõbõl a keringésbe vaszkuláris endothelialis növekedési faktor (VEGF) vagy stromalis sejtbõl származó faktor (SDF¹1) útján. Mind a VEGF, mind az SDF¹1 alapvetõen felülszabályozottak a hipoxiás szövetben, amely azt sugallja, hogy a VEGF és az SDF¹1 letelepedõjeleket konstituálnak, összegyûjtik a keringõ õssejteket, így fokozzák az endogén javítómechanizmusokat kritikus ischaemiát követõen (S. H. Lee és munkatársai, Early expression of angiogenesis factors in acute myocardial ischaemia and infarction, N. Engl. J. Med. 2000, 342:626–33).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Újabb kísérleti vizsgálatok alátámasztják, hogy a csontvelõbõl vagy vérbõl kinyert õssejtek hozzájárulnak az infarktussal érintett szívizom regenerálódásához és fokozzák az ischaemiás szívizom neovaszkularizációját (A. A. Kocher és munkatársai, Neovascularization of ischaemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function, Nat. Med. 2001, 7:430–6; D. Orlic és munkatársai, Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium, Nature 2001, 410:701–5; S. Fuchs és munkatársai, Catheter-based autologous bone marrow myocardial injection in no¹option patients with advanced coronary artery disease: a feasibility study, J. Am. Coll. Cardiol. 2003, 41:1721–4). Továbbá, felnõtt szülõi sejtek intravénás infúziója vagy szívizomba adott (intramiokardiális) injekciója hosszan tartó javulást eredményezett a szívfunkcióban, mind kísérleti úton kiváltott szívinfarktus, mind krónikus ischaemiás szívbetegségben szenvedõ betegek esetében. Klinikailag kimutatták, hogy felnõtt õs¹ és szülõi sejtek koszorúérbe adott infúziója megvalósítható és biztonságos mind akut szívinfarktusban szenvedõ betegekben, mind krónikus ischaemiás kardiomiopátiában szenvedõ betegekben (B. Assmus és munkatársai, Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI), Circulation 2002, 106:3009–17; B. E. Strauer és munkatársai, Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans, Circulation 2002, 106:1913–8). Egy ilyen sejtterápia, amelyet egy páciensben hajtanak végre mint autonóm sejtterápiát, jelentõs javulással jár mind a regionális, mind a globális bal kamrai funkcióban. Ischaemiás szívbetegségben szenvedõ betegek sejtterápiája sikerének elõfeltétele a transzplantált sejteknek a letelepedése, és ennélfogva szöveti beültetõdése a szívben a célterületen, különösen, ha a beadás intravaszkuláris útját választjuk. Bár a csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek, így például mesenchymalis és hematopoietikus õs¹ és szülõi sejtek száma hasonló ischaemiás szívbetegségben szenvedõ betegekben és egészséges kontrollokban, sajnos az ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciensekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek funkcionális aktivitása károsodott, és azok letelepedési kapacitása csökkent. A koszorúér-betegségben szenvedõ páciensekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek ezen funkcionális károsodása korlátozza azok potenciálját klinikai sejtterápiához. Ez különösen akkor lép fel, amikor a beadás intravaszkuláris útját választjuk, amely megkívánja, hogy a szülõi sejtek ellenálljanak a kemoattraktáns gradiensnek az ischaemiás szövet ellepése és az ott történõ elhelyezkedés érdekében. Az õs¹ és szülõi sejtek funkcionális aktivitása és elhelyezkedési kapacitása mérhetõ azok telepképzõ aktivitása vagy vándorló aktivitása meghatározásával, például VEGF vagy SDF¹1 hatására. Az õs¹ és szülõi sejtek vándorló vagy telepképzõ aktivitásának követése a sejtterápia elõtt helyettesítõ vizsgálatként szolgálhat azon páciensek azonosítására, akik nagyobb
1
HU 007 713 T2
elõnyt szerezhetnek sejtterápiából. Másrészrõl, újabban ismertették, hogy a teljesen funkcionális csontvelõbõl származó EPC¹k egészséges donor egerekbõl visszaállítják az elöregedõ host szívizom-angiogenezisét a károsodott neovaszkularizáció patkánymodelljében (J. M. Edelberg és munkatársai, Young adult bone marrow-derived endothelial precursor cells restore aging-impaired cardiac angiogenic function, Circ. Res. 2002, 90:e89–e93). Ezért elõnyös lenne, ha megfelelõ eszközökkel, például beadás elõtti farmakológiai vagy genetikai manipulációval ischaemiás szívbetegségben szenvedõ betegekbõl származó, károsodott õs¹ és szülõi sejtek aktivitása és funkcionalitása visszaállítható lenne, ezáltal a páciensek terápiás elõnye a sejtterápiából fokozható lenne. Meglepetéssel tapasztaltuk, hogy az ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciensekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek károsodott funkciója jelentõsen javítható az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz transzkripciós fokozójával történõ inkubálás útján. Az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz fokozott expressziója a páciensek sejtjeinek eNOS-transzkripciós fokozóval történõ, azok ismételt beadását megelõzõ ex vivo kezelése útján megvalósítva javítja vagy visszaállítja ezen sejtek funkcionális aktivitását, amint azt demonstráltuk mind in vitro transzmigrációs vizsgálat alkalmazásával, mind in vivo a hátulsó végtagi ischaemia patkánymodelljében, amint azt az alábbiakban ismertetjük. Utóbbi modellben a femorális artéria elkötése utáni neovaszkularizációt véráramlásméréssel határoztuk meg, és úgy találtuk, hogy az ischaemiás szívbetegségben szenvedõ betegekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek beadásának elõnyös hatása jelentõsen megnõtt eNOS-transzkripciós fokozóval történõ elõkezelés után. Az, hogy a tapasztalt hatást valóban az endothelialis NO¹szintáz fokozott aktivitása és NO¹képzõdés okozta, az NGmonometil-L-arginin (L¹NMMA) abrogációs hatása útján bizonyítottuk, amelyrõl ismert, hogy az eNOS és az NO¹képzõdés inhibitora. Az ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciensekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek inkubációja sem egy eNOS-transzkripciós fokozó, sem egy L¹NMMA jelenlétében nem eredményez megnövekedett funkcionális aktivitást. Ezért a találmány tárgya az endothelialis nitrogénoxid-szintáz transzkripciós fokozója az õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében történõ alkalmazásra egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, továbbá az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz transzkripciós fokozójának alkalmazása gyógyszer elõállítására õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésére egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, és eljárás gyógyszer elõállítására õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésére egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely szerint az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz transzkripciós fokozóját használjuk fel. Az endothelialis NO¹szintáz (eNOS, NOS-III) három izoenzim csoportjához tartozik, amelyek termelik a messzendzser nitrogén-oxid-molekulát (nitrogén-monoxid; NO) arginin oxidációja útján. Az endotheliumból
5
10
15
20
25
30
35
2
származó NO központi fontosságú számos kulcs kardiovaszkuláris mechanizmusban. Értágító hatása van és gátolja a vérlemezkék aggregációját, a leukocitáknak az endotheliumhoz történõ tapadását és az intimális (belsõ) simaizomsejtek proliferációját. Az endothelialis NO¹szintázt fiziológiai és patofiziológiai reguláció szabályozza mind a transzkripciós, mind poszttranszkripciós szinten. Az eNOS-expresszió felülszabályozása az endothelialis sejtekben hatásos eszköz különbözõ állapotok, ezen belül kardiovaszkuláris betegségek, így például szívkoszorú-betegség és atherogenesis kezelésére és megelõzésére. Vegyületeket – amelyek fokozzák az eNOS-transzkripciót – ismertetnek például a WO 02/064146, a WO 02/064545, a WO 02/064546 és a WO 02/064565 nemzetközi közzétételi iratokban. Az õs¹ és szülõi sejtek funkcionális kapacitására gyakorolt elõnyös hatást, amelyet az ilyen sejtek ex vivo kezelése eredményez ischaemiás szívbetegségekben szenvedõ páciensek sejtterápiájában, ezekben a referenciákban nem ismertették. Az eNOS fontosságát a csontvelõbõl származó õs¹ és szülõi sejtek mobilizálására a keringési rendszerbe napjainkban ismertették (A. Aicher és munkatársai, Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells, Nat. Med. 2003; 9: 1370–1376). A találmány egy elõnyös megvalósítási formájában azokat az eNOS-transzkripció-fokozókat alkalmazzuk, amelyeket a WO 02/064146, a WO 02/064545, a WO 02/064546 és a WO 02/064565 nemzetközi közzétételi iratokban és a megfelelõ szabadalmi dokumentumokban, így például az US 2003/0008915, az US 2003/0022935, az US 2003/0022939 és az US 2003/0055093 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek. A találmány egy elõnyös megvalósítási formájában a (I) általános képletû eNOS-transzkripció-fokozót alkalmazzuk
I 40
45
50
55
60 3
ahol a képletben n értéke 1, 2 vagy 3; R jelentése fenil- vagy Hetar-csoport, mind amelyik helyettesítetlen, mind amelyik egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenst hordoz a következõ csoportból: F¹; Cl¹; Br¹; C1–C3-alkil; C1–C3alkoxi-metil; 2¹amino-3,3,3-trifluor-propil¹; CF3; C3–C5alkándiil¹; fenil¹; heteroaril¹; benzil¹; heteroaril-metil¹; OH¹; C1–C3-alkoxi¹; fenoxi¹; trifluor-metoxi¹; 2,2,2-trifluor-etoxi¹; (C1–C4-alkil)COO; (C1–C3-alkil)-merkapto¹; fenil-merkapto¹; (C1–C3-alkil)-szulfonil¹; fenil-szulfonil¹; NH2¹; (C1–C4-alkil)-amino¹; di(C1–C4-alkil)-amino¹; (C 1 –C 3 -alkil)-CONH¹; (C 1 –C 3 -alkil)–SO 2 NH¹; (C 1 –C 3 -alkil)-CO¹; fenil¹CO; –OCH 2 O¹; –OCF 2 O¹; –CH 2 CH 2 O¹; COO(C 1 –C 4 -alkil)¹; –CONH 2 ¹; –CONH(C1–C4-alkil)¹; –CON[di(C1–C4-alkil)]¹; CN¹; –SO2NH2¹; –SO2NH(C1–C4-alkil)¹; –SO2N[di(C1–C4-alkil)]¹; pirrolidinil¹; piperidinil¹; morfolinil- és tiomorfolinilcsoport, ahol valamennyi heteroaril¹, fenil¹, hetero-
1
HU 007 713 T2
ariltartalmú és feniltartalmú csoport, amely adott esetben jelen van az említett fenil- vagy az említett Hetarcsoport említett szubsztituenseiben, helyettesítetlen vagy egy, kettõ vagy három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenssel helyettesített a következõ csoportból választva: F¹, CI¹, Br¹, CN¹, C1–C3-alkil¹, OH¹, C1–C3-alkoxi- vagy CF3-csoport; heteroaril- és a Hetar-csoport egymástól függetlenül 5¹tõl 10¹ig terjedõ szénatomszámú, aromás, monociklusos vagy biciklusos heterociklus, amely egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaz a következõk körébõl választva: N¹, O¹ és S¹atom; annak bármely sztereoizomer formájában vagy annak bármely arányban lévõ elegye formájában, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója. Ha a (I) általános képletû vegyületekben csoportok vagy szubsztituensek, így például fenil¹, heteroaril¹, alkil- stb. többször lehetnek jelen, akkor azok mindegyike egymástól függetlenül a jelzett jelentéssel rendelkezik, továbbá minden egyes esetben lehet egymással azonos vagy egymástól különbözõ. Erre példa a di(1–4 szénatomos alkil)-amino-csoport, amelyben az alkilcsoport lehet azonos vagy különbözõ. Az alkilcsoportok lehetnek lineárisak vagy elágazók, nyílt láncúak vagy gyûrûsek. Ez arra az esetre is vonatkozik, amikor azok más csoportok részei, például alkoxicsoportok, alkoxi-karbonil-csoportok vagy aminocsoportok, vagy amikor azok helyettesítettek. Az alkilcsoportok példáinak körébe tartoznak a metil¹, etil¹, propil¹, butil¹, ezek n¹izomerei, izopropil¹, izobutil¹, szek-butil¹, terc-butil-csoport. A jelen leírásban az alkil kifejezés kifejezetten magában foglalja a cikloalkilcsoportot és a cikloalkil-alkil-csoportokat (alkil cikloalkillal helyettesítve), amelyek legalább három szénatomot tartalmaznak. Az ilyen cikloalkilcsoportokra példák a ciklopropil- és a ciklobutilcsoport. A cikloalkilcsoportok lehetnek egy vagy több azonos vagy különbözõ 1–4 szénatomos alkilcsoporttal, különösen metilcsoporttal helyettesítve. Továbbá, eltérõ megjelölés hiányában az alkil kifejezés a jelen leírásban magában foglal helyettesítetlen alkilcsoportokat, továbbá olyan alkilcsoportokat is, amelyek egy vagy több, például egy, kettõ, három vagy négy, azonos vagy különbözõ csoporttal, például fenilcsoporttal helyettesítettek. Helyettesített alkilcsoportokban, például fenil-alkil-csoportban, a szubsztituensek jelen lehetnek bármely kívánt pozícióban. A 3–5 szénatomos alkándiil példái körébe tartoznak a következõk: –CH 2 CH 2 CH 2 –, –CH 2 –CH(CH 3 )–, –CH2CH2CH2CH2– vagy –CH2CH2CH2CH2CH2– csoportok. Eltérõ megállapítás hiányában a fent említett fenilcsoportok és heterociklusos csoportok, ezen belül a heteroarilcsoportok lehetnek helyettesítetlenek vagy hordozhatnak egy, kettõ, három vagy négy szubsztituenst a fenti definícióban megjelöltek körébõl, amely jelen lehet bármelyik kívánt pozícióban. Egyszeresen helyettesített fenilcsoportokban a szubsztituens jelen lehet a 2. pozícióban, a 3. pozícióban vagy a 4. pozí-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
cióban, kétszeresen helyettesített fenilcsoportokban a szubsztituensek jelen lehetnek a 2,3 pozícióban, a 2,4pozícióban, a 2,5-pozícióban, a 2,6-pozícióban, a 3,4pozícióban vagy a 3,5-pozícióban. Háromszorosan helyettesített fenilcsoportokban a szubsztituensek lehetnek a 2,3,4-pozícióban, a 2,3,5-pozícióban, a 2,3,6-pozícióban, a 2,4,5-pozícióban, a 2,4,6-pozícióban vagy a 3,4,5-pozícióban. Négyszeresen helyettesített fenilcsoportokban a szubsztituensek jelen lehetnek a 2,3,4,5-pozícióban, a 2,3,4,6-pozícióban vagy a 2,3,5,6-pozícióban. Eltérõ megállapítás hiányában a heteroarilcsoportok és a heterociklusos csoportok, így például a Hetar-csoport elõnyösen olyan heterociklusokból származnak, amelyek egy, kettõ vagy három azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaznak, elõnyösen olyan heterociklusokból származnak, amelyek egy vagy két azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaznak. A heterociklusos csoportokban a gyûrûk elõnyösen 5 tagú gyûrûk, 6 tagú gyûrûk vagy 7 tagú gyûrûk, elõnyösebben 5 tagú gyûrûk vagy 6 tagú gyûrûk. Azon monociklusos és biciklusos heterociklusos rendszerek példái, amelyekbõl a (I) általános képletû vegyületekben elõforduló csoportok származnak, a pirrol¹, a furán¹, a tiofén¹, az imidazol¹, a pirazol¹, az 1,2,3triazol¹, az 1,2,4-triazol¹, az 1,3-dioxol¹, az 1,3-oxazol(=oxazol¹), az 1,2-oxazol- (=izoxazol¹), 1,3-tiazol- (=tiazol), az 1,2-tiazole(=izotiazol¹), a tetrazol¹, a piridin¹, a piridazin¹, a pirimidin¹, a pirazin¹, a pirán¹, a tiopirán¹, az 1,4-dioxin¹, az 1,2-oxazin¹, az 1,3-oxazin¹, az 1,4oxazin¹, az 1,2-tiazin¹, az 1,3-tiazin¹, az 1,4-tiazin¹, az 1,2,3-triazin¹, az 1,2,4-triazin¹, az 1,3,5-triazin¹, az 1,2,4,5-tetrazin¹, az azepin¹, az 1,2-diazepin¹, az 1,3diazepin¹, az 1,4-diazepin¹, az 1,3-oxazepin¹, az 1,3tiazepine¹, az indol, a benzotiofén¹, a benzofurán¹, a benzotiazol¹, a benzoimidazol¹, a benzodioxol¹, a kinoline¹, az izokinolin¹, a cinnolin¹, a kinazolin¹, a kinoxalin¹, a ftalazin¹, a tienotiofének, az 1,8-naftiridin- és más naftiridinek¹, a pteridin- vagy fenotiazincsoport, ezek mindegyike telített formában (perhidroforma) vagy részlegesen telítetlen formában, például a dihidroformában vagy a tetrahidroformában) vagy teljesen telítetlen formában, azokban az esetekben, ahol a megfelelõ formák ismertek és stabilak, és a vegyületek definíciójának körébe tartoznak. A heteroaril kifejezés a jelen leírásban alkalmazva kétgyûrûs csoportokat foglal magában, amelyekben mindkét gyûrû aromás csoport, továbbá olyan kétgyûrûs csoportokat foglal magában, amelyekben csak egy gyûrû aromás. Ettõl függetlenül ugyanez vonatkozik a Hetar-csoportra. Megfelelõ heterociklusok körébe tartoznak például a telített heterociklus pirrolidin, piperidin, morfolin és tiomorfolin. Telítetlen heterociklusok tartalmazhatnak például egy, kettõ vagy három kettõs kötést a gyûrûrendszeren belül. 5 tagú gyûrûk és 6 tagú gyûrûk szintén lehetnek aromásak. Azon szubsztituensek, amelyek származhatnak ezen heterociklusokból, kapcsolódhatnak bármely megfelelõ szénatomon keresztül. Nitrogéntartalmú heterociklusokból származó csoportok, amelyek hidro-
1
HU 007 713 T2
génatomot vagy egy gyûrûalkotó nitrogénatomon egy szubsztituenst hordoznak, például a pirrol, az imidazol, a pirrolidin, a morfolin, a piperazin, szintén kapcsolódhatnak egy gyûrûalkotó nitrogénatomon keresztül, különösen ha a megfelelõ heterociklusos csoport egy szénatomhoz kapcsolódik. Például egy tienilcsoport jelen lehet 2¹tienil-csoportként vagy 3¹tienil-csoportként, egy furilcsoport jelen lehet 2¹furil-csoportként vagy 3¹furil-csoportként, egy piridilcsoport jelen lehet 2¹piridil-csoportként, 3¹piridil-csoport vagy 4¹piridil-csoportként, egy piperidinilcsoport jelen lehet 1¹piperidinil-csoportként (=piperidincsoport), 2¹piperidinil-csoportként, 3¹piperidinil-csoportként vagy 4¹piperidinil-csoportként, egy (tio)morfolinil-csoport jelen lehet 2¹(tio)morfolinilcsoportként, 3¹(tio)morfolinil-csoportként vagy 4¹(tio)morfolinil-csoportként (=tiomorfolincsoport). Egy 1,3-tiazolból vagy imidazolból származó csoport, amely egy szénatomon keresztül kapcsolódik, kapcsolódhat a 2. pozíción, a 4. pozíción vagy az 5. pozíción keresztül. Abban az esetben, ha egy heterociklusos csoport helyettesített, az hordozhat egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenst. Heterociklusos csoportokban a szubsztituensek jelen lehetnek bármely kívánt pozícióban, például egy 2¹tienil-csoport vagy 2¹furil-csoport a 3. pozícióban és/vagy a 4. pozícióban és/vagy az 5. pozícióban, egy 3¹tienil-csoportban vagy 3¹furil-csoportban a 2. pozícióban és/vagy a 4. pozícióban és/vagy az 5. pozícióban egy 2¹piridil-csoportban a 3. pozícióban és/vagy a 4. pozícióban és/vagy az 5. pozícióban és/vagy a 6. pozícióban egy 3¹piridil-csoportban a 2. pozícióban és/vagy a 4. pozícióban és/vagy az 5. pozícióban és/vagy a 6. pozícióban egy 4¹piridil-csoportban a 2. pozícióban és/vagy a 3. pozícióban és/vagy az 5. pozícióban és/vagy a 6. pozícióban. Megfelelõ nitrogéntartalmú heterociklusok jelen lehetnek N¹oxidokként vagy egy elleniont tartalmazó kvaterner sóként is, amely egy gyógyászatilag elfogadható savból származik. Piridilcsoportok például jelen lehetnek piridin-N-oxidokként. A találmány körébe tartozik a (I) általános képletû vegyületek valamennyi sztereoizomer formája. A (I) általános képletû vegyületekben jelen lévõ aszimmetriacentrumok mindegyike egymástól függetlenül rendelkezhet S¹konfigurációval vagy R¹konfigurációval. A találmány körébe tartozik valamennyi lehetséges enantiomer és diasztereomer és két vagy több sztereoizomer elegyei, például enantiomerek és/vagy diasztereomerek elegyei valamennyi arányban. Így a találmány szerinti vegyületek, amelyek jelen lehetnek enantiomerekként, megjelenhetnek enantiomertiszta formában, mind levorotációs, mind dextrorotációs antipódokként, racemátok formájában és a két enantiomer elegyeinek formájában valamennyi arányban. Cisz/transz izoméria esetében a találmány körébe tartoznak mind a cisz¹, mind a transz-formák, továbbá ezen formák elegyei bármely arányokban. Valamennyi ezen forma a jelen találmány körébe tartozik. Az egyedi sztereoizomerek elõállítása végrehajtható kívánt esetben egy elegy szokásos eljárásokkal történõ szeparálásával, például kromatográfiával vagy kristályosítással, sztereokémiailag
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
egyféle kiindulási anyagok alkalmazásával a szintézishez vagy sztereoszelektív szintézis útján. Adott esetben egy származékképzés végrehajtható a sztereoizomerek szeparálását megelõzõen. Sztereoizomerek elegyének elválasztása végrehajtható a (I) általános képletû vegyületek fázisában vagy a szintézis során egy intermedier fázisában. A találmány körébe tartozik valamennyi (I) általános képletû vegyület szerinti tautomer forma. Abban az esetben, ha a (I) általános képletû vegyületek egy vagy több savas vagy bázisos csoportot tartalmaznak, a találmány köréhez tartoznak azok megfelelõ, gyógyászatilag vagy toxikológiailag elfogadható sói is, különösen a gyógyászatilag felhasználható sóik. Ennek megfelelõen azon (I) általános képletû vegyületek, amelyek savas csoportot tartalmaznak, jelen lehetnek ezen csoportokon és alkalmazhatók a találmány szerint például alkálifémsókként, alkáliföldfémsókként vagy ammóniumsókként. Az ilyen sók konkrétabb példái körébe tartoznak a nátriumsók, a káliumsók, a kalciumsók, a magnéziumsók vagy az ammóniával vagy szerves aminokkal képzett sók, így például az etilaminnal, az etanol-aminnal, a trietanol-aminnal vagy az aminosavakkal képzett sók. Azon (I) általános képletû vegyületek, amelyek egy vagy több bázikus csoportot, azaz olyan csoportokat tartalmaznak, amelyek protonálhatók, jelen lehetnek és alkalmazhatók a találmány szerint azok szervetlen vagy szerves savakkal képzett addíciós sóik formájában. A megfelelõ savak példáinak körébe tartoznak a hidrogén-klorid, a hidrogén-bromid, a foszforsav, a kénsav, a salétromsav, a metánszulfonsav, a p¹toluolszulfonsav, a naftalin-diszulfonsavak, az oxálsav, az ecetsav, a borkõsav, a tejsav, a szalicilsav, a benzoesav, a hangyasav, a propionsav, a pivalinsav, a dietil-ecetsav, a malonsav, a borostyánkõsav, a pimelinsav, a fumársav, a maleinsav, az almasav, a szulfaminsav, a fenil-propionsav, a glükonsav, az aszkorbinsav, az izonikotinsav, a citromsav, az adipinsav és más, a szakember számára ismert savak. Ha a (I) általános képletû vegyületek egyidejûleg savas és bázikus csoportokat is tartalmaznak a molekulában, a találmány körébe tartoznak az említett sóformákon kívül a belsõ sók vagy betainok (ikerionok). A megfelelõ só kinyerhetõ a (I) általános képletû vegyületekbõl szokásos megoldásokkal, amelyek ismertek a szakember számára, mint amilyen például azoknak szerves vagy szervetlen savval vagy bázissal egy oldószerben vagy diszpergálószerben történõ érintkeztetésével, vagy más sókkal anioncserével vagy kationcserével. A találmány továbbá magában foglalja (I) általános képletû vegyületek szolvátjainak, így például hidrátjainak vagy alkoholokkal képzett adduktumainak, a (I) általános képletû vegyületek aktív metabolitjainak és a (I) általános képletû vegyületek származékainak és elõvegyületeinek alkalmazását, amelyek fiziológiailag tolerálható és lehasítható csoportokat, így például észtereket, amidokat tartalmaznak, és azon vegyületek alkalmazását, amelyekben a (I) általános képletben megjelölt N–H csoportot egy N¹alkil-csoport helyettesíti, így például N¹metil- vagy N¹acil-csoport helyettesíti, így
1
HU 007 713 T2
N¹acetil- vagy N¹argininil-csoport, ideértve az N¹acilcsoportban jelen lévõ funkciós csoporton képzett gyógyászatilag elfogadható sókat, feltéve, hogy azok mutatják a kívánt aktivitást a találmánnyal összhangban, megfelelõ körülmények között alkalmazva õs¹ és szülõi sejtek ex vivo kezelésére. A találmánnyal összhangban alkalmazott (I) általános képletû, különösen elõnyös vegyületek azok, amelyekben egy vagy több változó az alábbiakban megadott elõnyös jelentésekkel rendelkezik, ahol az elõnyös jelentések valamennyi kombinációja a találmány tárgyához tartozik. A (I) általános képletû valamennyi elõnyös vegyület tekintetében a találmány magában foglalja valamennyi sztereoizomer forma és azok elegyeinek valamennyi arányban történõ alkalmazását és azok gyógyászatilag elfogadható sóinak alkalmazását. Az n, azaz a (CH2)n polimetilén láncban a CH2 csoportok száma elõnyösen 1 vagy 3. A találmány egy kiviteli alakjában olyan (I) általános képletû vegyületet alkalmazunk, amelyben n értéke 1, azaz az indan-2-ilcsoport az R–COOH általános képletû sav amidja. A találmány egy másik kiviteli alakjában olyan (I) általános képletû vegyületet alkalmazunk, amelyben n értéke 3, azaz a 6,7,8,9-tetrahidro-5H-benzociklo-hepten6-il-csoport az R–COOH általános képletû sav amidja. R jelentése elõnyösen a következõk körébõl választott: 4¹fluor-fenil¹, 4¹klór-fenil¹, 4¹bróm-fenil¹, 4¹(C1–C3-alkoxi)-fenil¹, 4¹trifluor-metoxi-fenil¹, 2¹bróm4-fluor-fenil¹, 2¹klór-4-fluor-fenil¹, 3,4-dimetil-fenil¹, 2,4dimetil-fenil¹, 4¹klór-2-metil-fenil¹, 2¹hidroxi-4-metilfenil¹, 2¹hidroxi-4-etoxi-fenil, 2¹metoxi-4-metil-fenil, 4¹fenoxi-fenil, 3¹fluor-4-metil-fenil, benzo[1,3]dioxol5¹il, 2,2-difluor-benzo[1,3]dioxol-5¹il, 2,3-dihidro-benzofuran-5¹il, 1¹(4¹klór-fenil)-5-trifluor-metil-1H-pirazol-4¹il, 1¹(4¹fluor-fenil)-3,5-dimetil-1H-pirazol-4¹il, 1H¹benzotriazol-5¹il, 1H¹indol-4¹il, 1H¹indol-6¹il, 1¹izopropil-2-trifluor-metil-1H-benzimidazol-5¹il, 1¹metil-3-oxo-1‚2,3,4tetrahidro-kinoxalin-6¹il, 1¹fenil-5-trifluor-metil-1Hpirazol-4¹il, 2¹(2¹hidroxi-piridin-4¹il)-1H-benzimidazol5¹il, 2¹(4¹ciano-fenil)-1H-benzimidazol-5¹il, 2,4-dimetiloxazol-5¹il, 2,4-dimetil-pirimidin-5¹il, 2,4-dimetil-tiazol5¹il, 2,5-dimetil-1H-pirrol-3¹il, 2,5-dimetil-1-fenil-1Hpirrol-3¹il, 2,5-dimetil-1-piridin-4-il-metil-1H-pirrolil, 2,5dimetil-2H-pirazol-3¹il, 2,6-diklór-pirid-3¹il, 2,6-dimetoxipirid-3¹il, 2,6-dimetil-pirid-3¹il, 2¹amino-4,6-dimetil-pirid3¹il, 2¹amino-6-klór-pirid-3¹il, 2¹amino-pirid-3¹il, 2¹klór6-metil-pirid-3¹il, 2¹klórpirid-4¹il, 2¹ciklopropil-4-metiltiazol-5¹il, 2¹dimetil-amino-4-metil-tiazol-5¹il, 2¹dimetilamino-pirid-4¹il, 2¹etil-5-metil-2H-pirazol-3¹il, 2¹hidroxi6-metil-pirid-3¹il, 2¹metil-1H-benzimidazol-5¹il, 2¹metil3H-benzimidazol-5¹il, 2¹metil-pirid-3¹il, 2¹metil-6-trifluor-metil-pirid-3¹il, 2¹metil-tiazol-5¹il, 2¹(morfolin-4¹il)piridin-4¹il, 2¹(morfolin-4¹il)-pirimidin-5¹il, 2¹(pirrolidin1¹il)-piridin-4¹il, 3,5-dimetil-1H-pirazol-4¹il, 3¹amino-5,6dimetil-pirazin-2¹il, 3¹amino-5-metil-pirazin-2¹il, 3¹amino-pirazin-2¹il, 3¹dimetil-amino-4-metil-fenil, 3¹dimetilamino-fenil, 3H¹benzimidazol-5¹il, 1H¹benzimidazol5¹il, 3¹metánszulfonil-amino-2-metil-fenil, 3¹metánszulfonil-amino-fenil, 3¹metil-izoxazol-4¹il, 3¹(morfolin-4¹il)fenil, 3¹(piperidin-1¹il)-fenil, 3¹(pirrolidin-1¹il)-fenil,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
4¹(2,2,2-trifluor-etoxi)-fenil, 4,6-dimetil-pirid-3¹il, 4¹amino-2-etil-szulfanil-pirimidin-5¹il, 4¹amino-2-metilpirimidin-5¹il, 4¹klór-3-metánszulfonil-amino-fenil, 4¹klór-3-szulfamoil-fenil, 4¹metil-3-metil-amino-fenil, 4¹metil-tiazol-5¹il, pirid-2¹il, 5,6,7,8-tetrahidro-kinolin3¹il, 5¹amino-1-fenil-1H-pirazol-4¹il, 5¹metánszulfonil-2metil-fenil, 5¹metil-1-fenil-1H-pirazol-4¹il, 5¹metilizoxazol-3¹il, 5¹metil-pirid-3¹il, 5¹metil-pirazin-2¹il, 6¹klór-pirid-3¹il, 6¹cianopirid-3¹il, 6¹dimetil-amino-pirid3¹il, 6¹etinil-pirid-3¹il, 6¹metoxi-metil-pirid-3¹il, 6¹metoxipirid-3¹il, 6¹metil-2-metil-amino-pirid-3¹il, 6¹metil-aminopirazin-2¹il, 6¹metil-pirid-3¹il, 6¹(morfolin-4¹il)-pirid-3¹il, 6¹(pirrolidin-1¹il)-pirid-3¹il, imidazo[1,2¹a]piridine-2¹il, 6¹trifluor-metil-pirid-3¹il vagy pirimidin-4¹il. A heteroarilcsoport jelentése elõnyösen 5 tagútól 10 tagúig terjedõ atomszámú, aromás, monociklusos vagy biciklusos heterociklusos csoport, amely egy, kettõ vagy három, elõnyösebben egy vagy kettõ, azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaz a következõk körébõl választva: N, O és S. A heteroarilcsoport legelõnyösebben a következõk körébõl választott: furil, pirrolil, tienil, tiazolil, izotiazolil, oxazolil, izoxazolil, pirazolil, imidazolil, piridazinil, pirazinil, piridil, pirimidinil, benzodioxolil, benzoimidazolil, benzotiazolil, benzoxazolil, kinolinil, izokinolinil, kinoxalinil, kinazolil, indolil, benzofuranil, benzotiofenil és indazolil. A Hetar-csoport jelentése elõnyösen 5¹tõl 10¹ig terjedõ tagú, aromás, monociklusos vagy biciklusos heterociklusos csoport, amely egy, kettõ vagy három, elõnyösebben egy vagy kettõ, azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaz a következõk körébõl választva: N, O és S. A Hetar-csoport jelentése legelõnyösebben a következõk körébõl választott: furil, pirrolil, tienil, tiazolil, izotiazolil, oxazolil, izoxazolil, pirazolil, imidazolil, piridazinil, pirazinil, piridil, pirimidinil, benzodioxolil, benzoimidazolil, benzotiazolil, benzoxazolil, kinolinil, izokinolinil, kinoxalinil, kinazolil, indolil, benzofuranil, benzotiofenil és indazolil. A találmány egy különösen elõnyös kiviteli alakjában olyan (I) általános képletû vegyületet alkalmazunk, amelyben az n értéke 1 és az R csoport a fent felsorolt, elõnyös jelentések közül rendelkezik eggyel, annak bármely sztereoizomer formájában vagy azok elegye formájában bármely arányban, vagy gyógyászatilag elfogadható sója formájában. A találmány egy további, különösen elõnyös kiviteli alakjában egy olyan (I) általános képletû vegyületet alkalmazunk, amelyben n értéke 3 és az R csoport a fent felsorolt jelentések közül rendelkezik eggyel, annak bármely sztereoizomer formájában vagy annak bármely arányban képzett elegye formájában vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója formájában. Az ilyen különösen elõnyös (I) általános képletû vegyületek példáinak körébe tartoznak a következõk: 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid és 2,2-difluor-benzo[1,3]dioxol-5-karbonsav-indan-2-il-amide. A jelen találmány szerint alkalmazott vegyületek, különösen a (I) általános képletû vegyületek és azok prekurzorai szintetizálhatók a szakirodalomban ismertetett eljárásokkal vagy a szakember számára ismert eljárásokkal. A (I) általános képletû vegyületek szinteti-
1
HU 007 713 T2
zálhatók például az R–COOH általános képlet szerinti megfelelõ savból vagy annak egy származékából és a megfelelõ aminból egy amidkötést képezve. Ebbõl a célból a megfelelõ amin feloldható egy közömbös oldószerben, mint például vízben, izopropanolban, diklórmetánban, tetrahidrofuránban, toluolban vagy dioxánban, és reagáltatható bázis jelenlétében, például trietilamin vagy nátrium-hidroxid jelenlétében egy megfelelõ karbonsavszármazékkal, például karbonsav-kloriddal, például szobahõmérsékleten. A (I) általános képletû vegyületek elõállíthatók a megfelelõ aminnak a megfelelõ savval történõ kapcsolási reakciójával is egy bázis, például diizopropil-etil-amin és egy megfelelõ kapcsoló reagens, mint például egy karbodiimid, így például diciklohexil-karbodiimid vagy TOTU jelenlétében egy közömbös oldószerben, mint például tetrahidrofuránban, dioxánban vagy dimetil-formamidban, például szobahõmérsékleten. Kívánt esetben a kapott acil-amin ezután funkciós csoporttal látható el további vegyületek elõállítása érdekében. Valamennyi reakció a (I) általános képletû vegyületek szintézisére önmagában jól ismert a szakember számára és végrehajtható általános reakciókörülmények között a szakirodalomban, így például Houben-Weyl: Methoden der Organischen Chemie (Methods of Organic Chemistry), Thieme-Verlag, Stuttgart; vagy Organic Reactions, John Wiley & Sons, New York szakirodalmi helyen ismertetett eljárások szerint, vagy azokkal analóg módon. Az egyedi eset körülményeitõl függõen a (I) általános képletû vegyület szintézise során fellépõ mellékreakciók elkerülése érdekében szükséges vagy elõnyös lehet funkciós csoportok idõleges blokkolása védõcsoportok bevitelével és azok védõcsoport-mentesítése a szintézis egy késõbbi fázisában, vagy funkciós csoportok bevitele prekurzorcsoportok, például egy nitrocsoport formájában, amely egy aminocsoport prekurzora, amelyet egy késõbbi reakciólépésben a kívánt funkciós csoporttá alakítjuk. Ilyen szintézisstratégiák és védõcsoportok és prekurzorcsoportok, amelyek megfelelõk egy egyedi esetben, a szakember számára ismertek. Kívánt esetben a (I) általános képletû vegyületek tisztíthatók szokásos tisztítási eljárásokkal, például átkristályosítással vagy kromatográfiával. A (I) általános képletû vegyületek elõállításához a kiindulási vegyületek kereskedelmi forgalomban kaphatók vagy elõállíthatók a szakirodalomban ismertetett eljárások szerint vagy azokkal analóg módon. A találmány szerinti eNOS-transzkripció-fokozóval kezelt felnõtt õssejt és szülõi sejtek izolálása és további kezelése végrehajtható általános eljárások szerint, amelyeket ismertettek a szakirodalomban vagy a szakirodalomban ismertetett eljárásokkal analóg módon, és ezek a szakember számára jól ismertek. Az alkalmazott sejtek kinyerhetõk a páciens csontvelõjébõl, amelyet szokásos aspirációs eljárással szerzünk, és ezáltal ezek lehetnek csontvelõõssejtek és csontvelõ szülõi sejtek vagy csontvelõbõl származtatott õs¹ és szülõi sejtek. A csontvelõt a szokásos eljárással dolgozzuk fel, amely magában foglalhat sûrûséggradiens centrifugálás útján történõ frakcionálást, mononukleáris sejtek
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
izolálása érdekében. Mosás után a sejteket szokásos sejttenyésztõ közegben szuszpendáljuk, például egy kereskedelmi forgalomban kapható X–Vivo közegben (Cambrex, East Rutherford, New Jersey, USA), amely szérummentes közeg és megfelel emberekben történõ alkalmazásra. Más sejttenyésztõ közegként, amelyben a sejtek szuszpendálhatók a további kezelésre, amely megfelelõ kísérletes vizsgálatra, a kereskedelmi forgalomban kapható RPMI 1640 közeg (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) említhetõ. Általában a kapott sejtszuszpenzió heterogén sejtpopulációkból áll, amely hematopoietikus szülõi sejteket tartalmaz. A kapott sejtszuszpenzió jellemezhetõ, és például hematopoietikus és mesenchymalis õs¹ és szülõi sejtpopulációk azonosíthatók általános technikákkal, így például áramláscitometriás analízissel szokásos antitestek alkalmazásával. A sejtek funkcionális aktivitása mérhetõ, például egy telepképzõegység-próbával vagy azok vándorlási kapacitásának meghatározásával VEGF¹re vagy SDF1¹re történõ válaszreakcióként, amint azt fentebb említettük és részletesebben az alábbiakban ismertetjük. Ha a sejtszuszpenzió olyan sejteket tartalmaz, amelyek endothelialis szülõi sejtek, vagy amelyek endothelialis szülõi sejtekké fejlõdhetnek, amelyek másrészrõl endothelialis sejtekké fejlõdhetnek és kiváltják új véredények képzõdését, azaz elõsegítik a neovaszkularizációt az infarktusos területen. A csontvelõ mellett a találmány szerint alkalmazott szülõi sejtek kinyerhetõk például zsírszövetbõl vagy a páciens keringõ vérébõl is hasonló eljárásokkal, így adipóz szövetbõl származó szülõi sejteket vagy keringõ vérbõl származó szülõi sejteket kapunk sorrendben. A vérbõl kinyert sejtpopulációkat általában ex vivo több napig tenyésztjük az ismételt beadás elõtt. Mivel a szisztémiás keringésben jelen lévõ endothelialis szülõi sejtek csontvelõsejtekbõl származnak, a „csontvelõbõl származó” kifejezés megfelelõen alkalmazható a páciens csontvelõjébõl kinyert sejtekre és a vérvétel útján szerzett, vérbõl kapott sejtekre is. Az ischaemiás szívbetegségekben szenvedõ páciensekbõl származó õs¹ és szülõi sejtek kapott szuszpenziójának ex vivo kezelése a károsodott funkcionális aktivitás javítására és elhelyezkedési kapacitás javítására, ezáltal az ismételt beadásukat követõ neovaszkularizációra végrehajtható a sejttenyésztés általános körülményei között. A sejtek koncentrációja a szuszpenzióban, amely lehet egy szuszpenzió megfelelõ közegben, így például X–Vivo közegben, például teljes formuláció és nem kívánja további anyagok hozzáadását, lehet a körülbelül 100 000 egység/ml-tõl a körülbelül 5 000 000 egység/ml¹ig terjedõ tartományban, például körülbelül 1 000 000 egység/ml. Az eNOS-expressziófokozóval történõ kezelésre alkalmazott közeg kémhatása általában a körülbelül pH=6,5-tõl körülbelül pH=7,5¹ig terjedõ tartományban van, különösen a körülbelül pH=6,8-tól a körülbelül pH=7,3¹ig, amilyen pH a sejtek kezelése során jellemzõ. A sejtszuszpenziót az eNOS-transzkripció-fokozó oldatával egy megfelelõ, gyógyászatilag elfogadható oldószerben, így például vízben vagy egy szerves oldószerben, így például alko-
1
HU 007 713 T2
holban, így például etanolban vagy egy poliglükolban, például polipropilénglikolban vagy dimetil-szulfoxidban vagy az ilyen oldószerek elegyében keverjük össze. Az eNOS-transzkripció-fokozó oldata tartalmazhat gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat, így például sókat, pufferanyagokat vagy szolubilizálószereket is. Az eNOS-transzkripció-fokozó koncentrációja a keletkezõ elegyben általában körülbelül 1 nM¹tõl körülbelül 1 mM¹ig, különösen a körülbelül 0,1 mM-tõl a körülbelül 100 mM¹ig, például 1 mM-tõl körülbelül 10 mM¹ig terjedõ tartományban van, így például lehet körülbelül 5 mM. Az elegyet ezután steril körülmények között inkubáljuk egy olyan hõmérsékleten, amely általában körülbelül 37 °C nedves atmoszférában, amely például állhat körülbelül 5% szén-dioxidot tartalmazó levegõbõl. Az inkubációs idõszak az egyedi eset körülményeitõl függ, például az alkalmazott eNOS-transzkripció-fokozó hatásosságától. Általában ez körülbelül 6 órától körülbelül 48 óráig terjedõ idõszak, például körülbelül 12 órától körülbelül 24 óráig terjedõ idõszak, így például körülbelül 18 óra. Ha a keringõ vérbõl kinyert szülõi sejteket alkalmazzuk a találmány szerint, az eNOS-transzkripciófokozóval való inkubáció történhet a fent említett tenyésztés alatt, amelyet általában ilyen sejtekkel hajtunk végre. A kapott elegy közvetlenül beadható a páciensnek feldolgozás nélkül, mivel a benne lévõ eNOStranszkripció-fokozó egy hatóanyag, amely szintén elõnyös hatásokat vált ki a testben. Alternatív megoldásként a kezelt sejtek elõször szeparálhatók a kapott elegybõl centrifugálás útján, moshatók például pufferoldattal, ismét szuszpendálhatók, például olyan közegekben, mint amilyen az X–Vivo, és ez a szuszpenzió beadható a páciensnek. A találmány további tárgya az elõbb ismertetett eljárás õs¹ és/vagy szülõi sejtek elõállítására jobb funkcionális aktivitással, egy eNOS-transzkripció-fokozóval történõ kezelés útján, azaz eljárás õs¹ és/vagy szülõi sejtek elõállítására fokozott funkcionális aktivitással, amely szerint ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciensbõl származó õs¹ és/vagy szülõi sejteket kezelünk endothelialis nitrogén-oxid-szintáz-transzkripció fokozójával. A találmány tárgyát képezik továbbá gyógyszerek (gyógyászati készítmény vagy gyógyszerészeti preparátum), amely egy eNOS-transzkripció-fokozót, például egy (I) általános képletû vegyületet és/vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját és adott esetben egy vagy több segédanyagot tartalmaz, így például sókat vagy pufferanyagokat vagy szolubilizálószereket, õs¹ és szülõi sejtek ex vivo kezelésében ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, továbbá készlet vagy csomag ilyen kezelésben történõ alkalmazásra, amely további eszközökkel együtt tartalmaz ilyen gyógyszert ilyen alkalmazásra, például egy megfelelõ oldószert vagy közeget egy szilárd eNOS-transzkripció-fokozó feloldására és felhasználási útmutatót. A gyógyszer tartalmazhat például egy szilárd eNOS-transzkripció-fokozót egy üvegben, egy ampullában vagy egy üvegcsében, amelyet azután feloldunk az eNOS-transzkripció-fokozónak a sejtszuszpenzióhoz történõ hozzáadása elõtt vagy egy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
eNOS-transzkripció-fokozó oldatot, amely közvetlenül a sejtszuszpenzióhoz adható. Az eNOS-transzkripció-fokozóval történõ kezelés után kapott õs¹ és/vagy szülõi sejtek szuszpenziója beadható a páciensnek például szervezetileg intravénás injekcióval vagy infúzióval vagy közvetlenül a szívbe vagy a véredényekbe közel a szívhez, intramiokardiális injekció vagy koszorúérbe adott injekció vagy infúzió segítségével. A beadás közvetlenül az infarktusos szívizomba vagy a koszorúvéredényekbe történhet mûtét során vagy katéterezési eljárással, amint azt az alábbiakban részletesebben ismertetjük. A megfelelõ beadási eljárások a szakterületen kialakultak és a szakember számára jól ismertek. Az ischaemiás szívbetegség kifejezés a jelen leírásban alkalmazva úgy értendõ, hogy az magában foglal bármely szívbetegséget, amelyben elégtelen vérellátás történik vagy történt a szívizom egy vagy több régiójához, vagy amelyben orvosilag kívánatos a neovaszkularizáció vagy neoangiogenezis enyhítése, és magában foglal olyan betegségeket, mint amilyen például a szívkoszorú-betegség, a koszorúartéria-betegség, az akut koszorúér-szindróma, az angina pectoris, a szívinfarktus, az ischaemiás kardiomiopátia és az elzáródásos szívroham, amely utóbbi betegség lehet az ischaemia miatt. A találmány szerint kezelhetõ ischaemiás szívbetegség lehet akut vagy krónikus betegség. Példák eNOS-transzkripció-fokozók szintézise 4-Fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid 43,70 g (258 mmol) 2¹aminoindán-hidrokloridot és 53,43 g (528 mmol) trietil-amint adunk 250 ml of tetrahidrofuránhoz, 42,89 g (270 mmol) 4¹fluor-benzoil-kloridot adunk hozzá és az elegyet 2 óráig szobahõmérsékleten keverjük. A keletkezõ elegyet ezután jég/HCl elegyre öntjük, a kapott csapadékot szûrjük, NaHCO3oldattal és vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. A nyersterméket metanolból kristályosítjuk. Hozam: 47,8 g (73%) fehér színû, kristályos termékbõl. Olvadáspont: 167 °C Tömegspektrum: 256,1 [M+H+] 1H–NMR-spektrum (300 MHz, d -DMSO): 2,96 (dd, 6 2H, H1/3); 3,25 (dd, 2H, H3/1); 4,70 (sextett, 1H, H2); 7,12–7,19 (m, 2H, H4,7/5,6); 7,20–7,28 (m, 2H, H5,6/4,7); 7,30 (t, 2H, H3’, 5’); 7,95 (dd, 2H, H2’,6’); 8,68 (d, 1H, NH). A (I) általános képletû további vegyületek szintetizálhatók a következõ példaszerû A, B és C általános eljárások szerinti eljárásoknak megfelelõen.
A) eljárás 0,5 mmol (96 mg) 1¹etil-3-[3¹(dimetil-amino)-propil]karbodiimid-hidrokloridot és 0,5 mmol (87 ml) diizopro55 pil-etil-amint (DIPEA) feloldunk 2,5 ml diklór-metánban (DCM), hozzáadjuk 0,5 mmol megfelelõ sav 2,5 ml DCM-ben képzett oldatához és 10 percig szobahõmérsékleten keverjük. Ezután 0,7 mmol megfelelõ amint adunk hozzá és a keverést 1 éjszakán át folytatjuk. 60 A keletkezõ oldatot ezután kétszer 2 N HCl-lel és egy8
1
HU 007 713 T2
szer telített KHCO3-oldattal mossuk, MgSO4¹on szárítjuk és szûrjük. A szárazra párlás után kapott maradékot etil-acetát/hexán vagy metanol/dietil-éter elegybõl átkristályosítjuk vagy HPLC segítségével tisztítjuk. B) eljárás 0,75 mmol megfelelõ sav és 271 ml (1,575 mmol) DIPEA 5 ml tetrahidrofuránban képzett elegyéhez adunk 271 mg (0,825 mmol) O¹[(ciano-etoxi-karbonilmetilén)-amino]¹N,N,N’,N’-tetrametil-uronium-tetrafluor-borátot (TOTU) [1 ml dimetil-formamidban (DMF) feloldva]. 15 perc szobahõmérsékleten történõ kezelés után 0,9 mmol megfelelõ amin-hidroklorid és 172 ml (1 mmol) DIPEA 1 ml DMF-ban képzett elegyét adjuk hozzá. 6 óráig történõ keverés után az elegyet szûrjük és bepároljuk. A maradékot etil-acetátban felvesszük és egymást követõen 20 ml 1 N HCl-lel és 20 ml of 5%¹os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk. A keletkezõ szerves fázist bepároljuk és preparatív HPLC (RP 18, acetonitril/víz) segítségével tisztítjuk. C) eljárás 2,5 mmol megfelelõ amint elegyítünk 550 mg trietilaminnal és 5 ml dioxánnal, majd 2,5 mmol megfelelõ karbonsav-kloridot adunk hozzá és az elegyet szobahõmérsékleten 2 óráig keverjük. A keletkezõ elegyet ezután jég/HCl elegyre öntjük, a kapott csapadékot etilacetáttal extraháljuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk és töményítjük. Az így kapott maradékot preparatív HPLC segítségével frakcionáljuk. Az elõállított vegyületek egy példájaként a következõ említhetõ: 2,2-difluor-benzo[1,3]dioxol-5-karbonsav-indan-2-ilamid Olvadáspont: 147,5 °C Tömegspektrum: 318,2 [M+H+] 1H–NMR-spektrum (400 MHz, d -DMSO): 2,91–2,99 6 (m, 2H, H¹1/H¹3); 3,22–3,30 (m, 2H, H¹3/H¹1); 4,69 (sextett, 1H, H¹2); 7,13–7,19 (m, 2H, H-4, H¹7 vagy H-5, H¹6); 7,21–7,28 (m, 2H, H-4, H¹7 vagy H-5, H¹6); 7,50 (d, 1H, H¹6’H7’); 7,80 (d, 1H, H¹7’/H6); 7,88 (s, 1H, H4’); 8,71 (d, 1H, NH). eNOS-transzkripció aktiválásának mérése Az eNOS-transzkripció aktiválódását részleteiben a Li és munkatársai által Activation of protein kinase C alpha and/or epsilon enhances transcription of the human endothelial nitric oxide synthase gene, Mol. Pharmacol. 1998, 53:630–637 szakirodalmi helyen ismertetettek szerint mértük. Röviden, az eNOS gén kiindulási kodonja 3,5 kB hosszú 5’ fragmentumát klónoztuk, szekvenáltuk és szentjánosbogár luciferáz expressziós plazmidokba klónoztuk az eNOS promoter aktiválódásának riportergén aktivitása útján történõ követése érdekében. Egy humán endothelialis sejtvonalat stabilan transzfektáltunk és ezen promoter-riporter konstrukt expresszálását használtuk vegyülettesztelésre. A sejteket 18 óráig vegyületekkel inkubáltuk. Valamennyi vegyületet elõzetesen steril dimetil-szulfoxidban
2
(DMSO) oldottuk fel. A komplett közegben 0,5% DMSO végsõ koncentrációt engedtünk meg. A riportergén-expresszió kiváltását ezen sejtekben standard luciferáz vizsgálati rendszer alkalmazásával (Promega, Madi5 son, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok; katalógusszám E150) mértük a gyártó utasításai szerint. A luciferázindukciót vegyületekkel inkubált sejtekben összehasonlítottuk azokkal, amelyeket önmagukban oldószerrel inkubáltunk. A két aktivitás arányait (transzkripcióin10 dukció-arány, TIR) a vegyület koncentrációjának függvényében ábrázoltuk. Tipikusan TIR-értékek alacsony koncentrációknál 1 aránynál kezdõdtek, jelezve, hogy nincs vegyülethatás, és a maximális TIR-értékig kiterjedtek TIR(max), amely az eNOS-transzkripció fokozó15 dását jelzi. A transzkripcióindukciós arányok EC50-értékeit mint a vegyületkoncentráció függvényét grafikusan meghatároztuk.
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
Csontvelõsejtek izolálása Leszívott csontvelõt gyûjtöttünk összesen 9 egészséges kontrollból és 25 stabil szívkoszorú-betegségben szenvedõ és szívinfarktus kórtörténetével rendelkezõ, 18 és 75 év közötti életkorú pácienstõl. A pácienseknek regionális szívfalmozgási abnormalitásuk, patent natív véredényük, koszorúartéria bypass graftjuk, vagy collateralis artériájuk volt. Mivel a szívizom-ischaemiáról ismert, hogy mobilizálja a csontvelõbõl származó szülõi sejteket, azon pácienseket kizártuk, ahol bizonyítást nyert a legutolsó 4 hét alatt indukálható vagy maradandó szívizom-ischaemia. További kizárási kritériumok voltak az aktív vagy krónikus fertõzés jelenléte, az utolsó 2 hónapon belüli operációk vagy trauma, bizonyított rosszindulatú betegségek, aktív gyomor-bél rendszeri vérzés, kontrollálhatatlan magas vérnyomás (160/100 Hgmm fölött), stroke az elmúlt 2 éven belül, AV¹aneurizma, vese- vagy májelégtelenség, 100 000/ml-nél nagyobb thrombocitopénia, anémia 8,5 g/dl-nél kisebb hemoglobinnal, mentális retardáció, más klinikai vizsgálatra való beiratkozás vagy a részvételre való hajlandóság hiánya. Szintén kizártuk a terhes és premenopauzális nõket. A Frankfurti Johann Wolfgang Goethe Egyetem Kórházának (Németország) Etikai Bizottsága jóváhagyta a protokollt, és a vizsgálatot a Helsinki Deklarációval összhangban végeztük. Minden egyes pácienstõl írott tájékoztatást magában foglaló hozzájáruló nyilatkozatot szereztünk be. Összesen 50 ml csontvelõt szívtunk le minden egyes résztvevõtõl. A csontvelõ õs¹ és szülõi sejteket sûrûséggradiens-centrifugálás útján izoláltuk. Két mosási lépés után a sejteket 10 ml X¹vivo 10 közegben újraszuszpendáltuk (gentamicin és fenolvörös nélkül; Cambrex, East Rutherford, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok). A sejtszuszpenzió heterogén sejtpopulációból áll, ezen belül hematopoietikus szülõi sejtekbõl. A csontvelõ õs¹ és szülõi sejteket áramláscitometria segítségével analizáltuk. A hematopoietikus és mesenchymalis õs¹ és szülõi sejtpopulációk azonosítása érdekében közvetlenül konjugált antitesteket alkalmaztunk humán CD45 (Becton Dickinson, Franklin Lakes,
1
HU 007 713 T2
New Jersey, Amerikai Egyesült Államok), CD34 (FITCcímkével ellátott; BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), CD133 (APC-címkével ellátott; BD Pharmingen), CD14 (FITC-címkével ellátott; BD Pharmingen), CXCR4 (APC-címkével ellátott, BD Pharmingen), és CD49d (APC-címkével ellátott; BD Pharmingen) ellen. A származási panelt a BD Pharmingen vállalattól szereztük be (amely tartalmazott FITC-címkével ellátott CD3¹at, CD14¹et, CD16¹ot, CD19¹et, CD20¹at és CD56¹ot) és kiegészítettük közvetlenül is alkalmazva FITC-konjugált antitesteket CD15-tel és glükoforin A¹val szemben (mindkettõt a BD Pharmingen vállalattól szereztük be). Csontvelõsejtek eNOS-transzkripció-fokozókkal történõ kezelése Az eNOS-transzkripció-fokozó 4¹fluor-N-(indan-2¹il)benzamiddal történõ inkubáláshoz 1 ml 1 000 000 õs¹ és szülõi sejtnek 1 ml X–Vivo 10 sejttenyésztõ közegben képzett szuszpenzióját elegyítettük 1 ml 4¹fluor-N(indan-2¹il)-benzamid dimetil-szulfoxidban (DMSO) képzett oldatával, amelyet 1,275 mg 4¹fluor-N-(indan-2¹il)benzamidnak 1 ml DMSO-ban történõ feloldásával állítottunk elõ. A 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid koncentrációja a keletkezõ elegyben 5 mM volt. Az eNOStranszkripció-fokozó 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamiddal történõ inkubációhoz és az NG-monometil-L-arginin (L¹NMMA) inhibitorral történõ inkubációhoz a 4¹fluor-N(indan-2¹il)-benzamid mellett L¹NMMA¹t (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) adtunk a sejtszuszpenzióhoz, így a 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamiddal képzett elegy koncentrációja 5 mM és L¹NMMA koncentrációja 1 mM lett. Az inkubációt 18 óráig 37 °C hõmérsékleten 5% szén-dioxidot tartalmazó levegõatmoszférában hajtottuk végre. A sejteket centrifugálás útján izoláltuk, kétszer PBS-sel mostuk és X–Vivo 10¹ben újraszuszpendáltuk. A csontvelõsejtek funkcionális aktivitásának mérése A telepképzõ aktivitás méréséhez csontvelõ õs¹ és szülõi sejteket (1×105/edény) oltottunk metil-cellulózlapokra (Methocult GF H4535, amely õssejtfaktort, granulocitatelep-serkentõ faktort, granulocita-makrofág telepserkentõ faktort, interleukin–3¹at és interleukin–6¹ot tartalmaz; CellSystems, St. Katharinen, Németország). A lapokat fáziskontraszt mikroszkópia segítségével tanulmányoztuk és a telepképzõ granulocita-makrofág egységeket (CFU¹GM; telep: több mint 50 sejt) 14 nappal az inkubálás után számláltuk. A csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek vándorlási kapacitásának méréséhez összesen 1×106 csontvelõ õs¹ és szülõi sejtet ismételten szuszpendáltunk 250 ml X–Vivo 10¹ben és egy módosított Boyden-kamra matrigéllel töltött felsõ kamrájába helyeztük (BioCoat inváziós vizsgálat, 8 mm pórusméret, Becton Dickinson Labware, Two Oak Park, Bedford, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok). Ezután a kamrát egy 24 üregû tenyésztõedénybe helyeztük, amely 500 ml endothelialis alapközeget (EBM) tartalmazott kiegészítve vagy fosz-
2
fátpufferolt sóoldattal (PBS), 50 ng/ml VEGF¹el, vagy 100 ng/ml SDF-1-gyel. A transzmigrált sejteket 24 óra, 37 °C hõmérsékleten történõ inkubáció után számláltuk. 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
In vivo hátulsóvégtag-ischaemiás modell egerekben A csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek neovaszkularizációs kapacitását a hátulsóvégtag-ischaemia egy patkánymodelljében vizsgáltuk 8–10 hetes életkorú athymiás NMRI csupasz egerek (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával; az állatok tömege 18–22 g volt. A femorális artéria proximális részletét, ezen belül a felületi és mély elágazást, továbbá a saphena artéria távoli részletét egy 7–0 selyemcérnával elkötöttük. Valamennyi artériás elágazást az elkötések között elpusztítottunk egy elektromos koagulátor alkalmazásával. A felfekvõ bõrt három sebészeti kapocs alkalmazásával összezártuk. 24 óra múlva csontvelõ õs¹ és szülõi sejt X–Vivo 10¹ben képzett szuszpenzióját intravénásan injektáltuk (5×104, 5×105 vagy 5×106 sejt/egér; n=5/csoport). Két hét múlva a végtagperfúziót meghatároztuk. Specifikusan az ischaemiás (jobb) végtag/normál (bal) végtag véráramarányt mértük lézer Doppler véráramlásméter (Laser Doppler Perfusion Imager System, MoorLDIMark 2, Moor Instruments, Wilmington, Delaware, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával. A leolvasás megkezdését megelõzõen 37 °C hõmérsékletû melegítõlapra helyeztük az egereket a hõmérsékletbeli variációk minimalizálása érdekében. Lézer Doppler színképek kétszeri felvétele után az ischaemiás és nem ischaemiás végtagok átlagos perfúzióit kiszámítottuk a színes hisztogramképek alapján. A változók, ezen belül a külsõ fény és hõmérséklet minimalizálása érdekében a számított perfúziót az ischaemiás és a nem ischaemiás hátulsó végtag perfúzió arányaként fejeztük ki. Hisztológiai (szövettani) értékeléshez a szövetvaszkularizációt az adduktor és félmembrános izmok 5 mm¹es fagyott szekcióiban határoztuk meg az ischaemiás és nem ischaemiás végtagból. Az endothelialis sejteket FITC-jelzett monoklón antitesttel jelöltük meg, amelyeket CD146 ellen irányítottunk (Chemicon, Temecula, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok). A kapillárissûrûséget a kapillárisok/miociták számaként fejeztük ki. Humán csontvelõ õs¹ és szülõi sejteket azonosítottunk HLA-DR-APC-jelzett antitestekkel történõ megjelöléssel (BD Pharmingen, San Diego, California, Amerikai Egyesült Államok) és CD146-FITC-jelzett antitestekkel.
Csontvelõsejtek beadása pácienseknek Egy eNOS-transzkripció-fokozóval kezelt csontve55 lõsejtek beadása egy páciensnek végrehajtható a következõ katéterezési eljárással szülõi sejttranszplantációhoz. Egy drót feletti ballon, 0,5 mm¹rel túlméretezett katétert vezetünk az elõzetesen implantált stentbe. Az infúzióval beadott sejtek adhéziójának és po60 tenciális transzmigrációjának lehetõvé tétele érdeké10
1
HU 007 713 T2
ben az endotheliumon keresztül, a ballont alacsony nyomással felfújjuk, így teljesen blokkoljuk a véráramot 3 percig, mialatt 3,3 ml szülõi sejtszuszpenziót infúzióval juttatunk be a távoli részen az elzáró ballonhoz képest a ballonkatéter központi bemenetén keresztül. Ezt az eljárást háromszor megismételjük, összesen 10 ml szülõi sejtszuszpenzió infúziójának elhelyezése érdekében, a folyamatot 3 perces visszaáramlással szakítjuk meg a ballon leengedése útján az extenzív ischaemia minimalizálása érdekében. A szívkoszorúba történõ sejttranszplantáció befejezése után ismételten koszorúér-angiográfiát végzünk a véredény-kapcsolódás és a kontrasztanyag nem kívánt kiáramlásának meggátlásáról való meggyõzõdés érdekében. A statisztikai analízist általános eljárásokkal hajtjuk végre. Eltérõ megjelölés hiányában a folyamatos változók eredményét középértékekként ± átlagos eltérésként fejezzük ki. A csoportok közötti összehasonlításokat t¹próbával (kétoldalú) vagy ANOVA-val analizáltuk kettõnél több alcsoporttal rendelkezõ kísérletekre. Post hoc tartományvizsgálatokat és páronkénti többszörös összehasonlításokat hajtottunk végre a t¹próbával (kétoldalú) Bonferroni-beállítással. A kategóriaváltozók összehasonlítását Pearson-féle c2-teszttel generáltuk. A csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek in vitro karakterisztikáinak vakvizsgálata után az eredményeket összevontuk az in vivo vizsgálatokból származó eredményekkel. A csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek in vitro meghatározóinak azonosításához azok in vivo neovaszkularizációs kapacitásához többváltozós lineáris regresszióanalízist hajtottunk végre. A 0,05-nél kisebb P¹értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Valamennyi analízist SPSS 11,5 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) készülékkel hajtottunk végre. A következõ eredményeket kaptuk. eNOS-transzkripció aktivációjának mérése A 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid vegyület az eNOS-transzkripció aktiválására végrehajtott luciferázvizsgálatban 0,8 mM EC50 és 4,10 TIR(max) értéket mutatott. A 2,2-difluor-benzo[1,3]dioxol-5-karbonsav-indan2-il-amid az eNOS-transzkripció aktiválására végrehajtott luciferázvizsgálatban 0,14 mM EC50-értéket és 2,7 TIR(max) értéket mutatott.
5
10
15
20
25
2
A páciensekbõl származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek migrációs válaszhatása SDF-1¹re 46,3±26,2×1000 migrált sejt volt, szemben a 108,6±40,4×1000 vándorolt sejttel az egészséges kontrollokból származó sejtekre (P<0,001). Az egészséges kontrollokból származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek migrációs válaszhatása SDF-1¹re 18 órával PBS-sel történõ kezelés után 126.5.3±41,7×1000 vándorolt sejt volt szemben a 111,2±38,5×1000 vándorolt sejttel az egészséges kontrollokból származó sejtekre 18 órával a 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamiddal (5 mM) (P<0,01) kezelés után. A páciensekbõl származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek migrációs válaszhatása SDF-1¹re 18 órával a PBS-sel történõ kezelés után 38,0±13,7×1000 vándorolt sejt volt, szemben a 74,0±20,7×1000 vándorolt sejttel, azokra a sejtekre, amelyek páciensekbõl származtak 18 órával 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamiddal (5 mM) (P<0,01) történõ kezelés után. A páciensekbõl származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek migrációs válaszhatása SDF-1¹re 18 órával a 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamiddal (5 mM) és N G monometil-L-argininnel (L¹NMMA) (1 mM) történõ kezelés után 23,9±7,4×1000 vándorolt sejt volt, szemben a 74,3±21,5×1000 vándorolt sejttel egészséges kontrollokból származó sejtekre, 18 órával 4¹fluor-(N¹indan2¹il)-benzamiddal (5 mM) (P<0,01) történõ kezelés után.
In vivo hátulsóvégtag-ischaemiás modell egerekben Az õs¹ és szülõi sejtek hatásának összehasonlítását 5×105 sejt/egér sejtkoncentrációban hajtottuk végre, amely koncentrációnál az egészséges kontrollokból 35 származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejtekkel a maximális terápiás hatást értük el. A különbözõ tesztcsoportokban a következõ lézer Doppler-származtatott relatív véráramlás-értékeket [véráramarány ischaemiás (jobb) végtag/normál 40 (bal) végtag százalékban] határoztuk meg csontvelõ õs¹ és szülõi sejtek beadása után a specifikáltak szerint. 30
Nincs sejt
21,9±10,8%
n=11
Sejtek egészséges kontrollokból
72,7±18,7%
n=24
Sejtek kezeletlen páciensekbõl
40,7±12,2%
n=24
45
Csontvelõsejtek funkcionális aktivitásának 50 Sejtek 18 óráig 5 mM 59,1±11,6%* n=24 mérése 4¹fluor-N-(indan-2¹il)A betegekbõl származó csontvelõ õs¹ és szülõi sejbenzamiddal kezelt tek telepképzõ aktivitása 37,3±25,0 CFU-GM/edény páciensekbõl volt, szemben a 113,8±70,4 CFU-GM/edénnyel az Sejtek 18 óráig 5 mM 39,7±10,3% n=18 egészséges kontrollokból származó sejtekre, (P=0,009). 55 4¹fluor-N-(indan-2¹il)A páciensekbõl származó csontvelõ õs¹ és szülõi benzamid és 1 mM sejtek vándorlási válasza VEGF¹re 34,0±24,2×1000 vánL¹NMMA-val kezelt dorolt sejt volt, szemben az 54,8±29,3×1000 vándorolt páciensekbõl sejtre az egészséges kontrollokból származó sejtekre (P=0,027). 60 * P<0,001 szemben páciensekbõl származó sejtek, kezeletlen 11
1
HU 007 713 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciós fokozójának alkalmazása gyógyszer elõállítására õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésére ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz-transzkripció fokozója egy (I) általános képletû vegyület
5
10
(I) 15 ahol a képletben n értéke 1, 2 vagy 3; R jelentése fenil- vagy Hetar-csoport, amely lehet mind helyettesítetlen, mind egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenst hordozó a következõ csoportok körébõl választva: F¹; Cl¹; Br¹; C1–C3-alkil¹; C1–C3-alkoxi-metil¹; 2¹amino-3,3,3-trifluor-propil¹; CF3; C3–C5-alkándiil¹; fenil¹; heteroaril¹; benzil¹; heteroaril-metil¹; OH¹; C 1 –C 3 -alkoxi¹; fenoxi¹; trifluormetoxi¹; 2,2,2-trifluor-etoxi¹; (C 1 –C 4 -alkil)-COO; (C1–C3-alkil)-merkapto¹; fenil-merkapto¹; (C1–C3-alkil)szulfonil¹; fenil-szulfonil¹; NH2¹; (C1–C4-alkil)-amino¹; di(C1–C4-alkil)-amino¹; (C1–C3-alkil)-CONH¹; (C1–C3alkil)-SO2NH¹; (C1–C3-alkil)-CO¹; fenil¹CO; ¹OCH2O¹; ¹OCF2O¹; ¹CH2CH2O¹; COO(C1–C4-alkil)¹; ¹CONH2¹; ¹CONH(C 1 ¹C 4 -alkil)¹; ¹CON[di(C 1 ¹C 4 -alkil)]¹; CN¹; ¹SO2NH2¹; ¹SO2NH(C1–C4-alkil)¹; ¹SO2N[di(C1¹C4-alkil)]¹; pirrolidinil¹; piperidinil¹; morfolinil- és tiomorfolinilcsoport, ahol valamennyi heteroaril¹, fenil¹, heteroariltartalmú és feniltartalmú csoport, amely adott esetben jelen van az említett fenil- vagy az említett Hetarcsoport említett szubsztituenseiben, helyettesítetlen vagy egy, kettõ vagy három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenssel helyettesített a következõ csoportból választva: F¹, Cl¹, Br¹, CN¹, C1–C3-alkil¹, OH¹, C1–C3-alkoxi- vagy CF3-csoport; heteroaril- és a Hetar-csoport egymástól függetlenül 5–10 tagú, monociklusos vagy biciklusos heterociklus, amely egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaz a következõk körébõl választva: N¹, O¹ és S¹atom; annak bármely sztereoizomer formájában vagy annak bármely arányban lévõ elegye formájában, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója. 3. Az 1. és/vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az endothelialis nitrogén-oxid-szintáztranszkripció fokozója a következõk körébõl választott vegyület: 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid és 2,2-difluorbenzo[1,3]dioxol-5-karbonsav-indan-2-il-amid. 4. Az 1–3. igénypontok közül egy vagy több szerinti alkalmazás, amelyben az õs¹ és/vagy szülõi sejteket a páciens csontvelõjébõl nyerjük ki. 5. Az 1–4. igénypontok közül egy vagy több szerinti alkalmazás, amelyben az õs¹ és/vagy szülõi sejteket az
20
25
30
35
40
2
endothelialis nitrogén-oxid-szintáz-transzkripció fokozójával 6–48 óráig terjedõ idõszakra inkubáljuk. 6. Az 1–5. igénypontok közül egy vagy több szerinti alkalmazás, amelyben az ischaemiás szívbetegség szívkoszorú-betegség, koszorúartéria-betegség, akut szívkoszorú-szindróma, angina pectoris, szívinfarktus, ischaemiás kardiomiopátia vagy elzáródásos szívroham. 7. Az 1–6. igénypontok közül egy vagy több szerinti alkalmazás, amelyben a kezelt õs¹ és/vagy szülõi sejteket a páciensnek intravénás, szívkoszorúba adott vagy szívizomba adott injekció vagy infúzió útján adjuk be. 8. Eljárás õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely szerint az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciófokozóját alkalmazzuk. 9. Eljárás megnövekedett funkcionális aktivitással rendelkezõ õs¹ és/vagy szülõi sejtek elõállítására, amely szerint egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciensbõl származó õs¹ és/vagy szülõi sejteket ex vivo kezeljük egy endothelialis nitrogén-oxid-szintáz transzkripció fokozóval. 10. Gyógyászati készítmény õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésben történõ alkalmazásra egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciós fokozóját tartalmazza. 11. Gyógyászati készítmény õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében történõ alkalmazásra egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely a 2. és/vagy 3. igénypontban meghatározott endothelialis nitrogén-oxid-szintáz-transzkripció fokozóját tartalmazza. 12. Az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciófokozója õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében történõ alkalmazásra egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában. 13. A (I) általános képletû endothelialis nitrogénoxid-szintáz transzkripciófokozója
(I) 45 ahol a képletben n értéke 1, 2 vagy 3; R jelentése fenil- vagy Hetar-csoport, amely lehet mind 50 helyettesítetlen, mind egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenst hordozó a következõ csoportok körébõl választva: F¹; Cl¹; Br¹; C1–C3-alkil¹; C1–C3-alkoxi-metil; 2¹amino-3,3,3-trifluor-propil¹; CF3; C3–C5-alkándiil¹; fenil¹; heteroaril¹; benzil¹; hetero55 aril-metil¹; OH¹; C1–C3-alkoxi¹; fenoxi¹; trifluor-metoxi¹; 2,2,2-trifluor-etoxi¹; (C1–C4-alkil)-COO; (C1–C3-alkil)merkapto¹; fenil-merkapto¹; (C1–C3-alkil)-szulfonil¹; fenil-szulfonil¹; NH2¹; (C1–C4-alkil)-amino¹; di(C1–C4-alkil)-amino¹; (C 1 –C 3 -alkil)–CONH¹; (C 1 –C 3 -al60 kil)–SO2NH¹; (C1–C3-alkil)–CO¹; fenil-CO¹; –OCH2O¹; 12
1
HU 007 713 T2
–OCF2O¹; –CH2CH2O¹; COO(C1–C4-alkil)¹; –CONH2¹; –CONH(C1–C4-alkil)¹; –CON[di(C1–C4-alkil)]¹; CN¹; –SO2NH2¹; –SO2NH(C1–C4-alkil)¹; –SO2N[di(C1–C4alkil)]¹; pirrolidinil¹; piperidinil¹; morfolinil- és tiomorfolinil-csoport, ahol valamennyi heteroaril¹, fenil¹, heteroariltartalmú és feniltartalmú csoport, amely adott esetben jelen van az említett fenil- vagy az említett Hetarcsoport említett szubsztituenseiben, helyettesítetlen vagy egy, kettõ vagy három vagy négy azonos vagy különbözõ szubsztituenssel helyettesített a következõ csoportból választva: F¹, Cl¹, Br¹, CN¹, C1–C3-alkil¹, OH¹, C1–C3-alkoxi- vagy CF3-csoport; heteroaril- és a Hetar-csoport egymástól függetlenül 5–10 tagú, aromás, monociklusos vagy biciklusos heterociklus, amely egy, kettõ, három vagy négy azonos vagy különbözõ heteroatomot tartalmaz a következõk körébõl választva: N¹, O¹ és S¹atom; annak bármely
2
sztereoizomer formájában vagy annak bármely arányban lévõ elegye formájában, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója. Õs- és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében törté5 nõ alkalmazásra egy ischaemiás szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában. 14. Az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciófokozója õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében történõ alkalmazásra egy ischaemiás szív10 betegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely transzkripciófokozó a 4¹fluor-N-(indan-2¹il)-benzamid. 15. Az endothelialis nitrogén-oxid-szintáz egy transzkripciófokozója õs¹ és/vagy szülõi sejtek ex vivo kezelésében történõ alkalmazásra egy ischaemiás 15 szívbetegségben szenvedõ páciens sejtterápiájában, amely transzkripciófokozó a 2,2-difluor-benzo[1,3]dioxol-5-karbonsav-indan-2-il-amid.
13
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
