(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000008251T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 008 251

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/605

(21) Magyar ügyszám: E 05 850211 (22) A bejelentés napja: 2005. 11. 18. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050850211 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1819729 2006. 06. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1819729 B1 2009. 04. 22.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 102004058306 2004. 12. 01.

(73) Jogosult: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, 65929 Frankfurt am Main (DE)

DE

(2006.01) A61K 38/22 (2006.01) A61K 38/26 (2006.01) C12N 15/16 (2006.01) C07K 14/575 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06058620 PCT/EP 05/012365

(72) Feltalálók: HABERMANN, Paul, 65817 Eppstein (DE); DECKER, Heinrich, 65926 Frankfurt (DE); LATTEMANN, Claus, 65812 Bad Soden (DE); MANEG, Oliver, 65936 Frankfurt (DE); SALAGNAD, Christophe, 61440 Oberursel (DE); ZOCHER, Frank, 65926 Frankfurt (DE) (54)

Eljárás karboxiterminálison amidált peptidek elõállítására

(57) Kivonat

HU 008 251 T2

A találmány tárgyát képezi karboxiterminálison (C¹terminálison) amidált peptidek elõállítása C¹terminálison amidált lizinnel, elõnyösen GLP¹1 biológiai aktivitásával, ezek kémiai és/vagy biotechnológiai elõanya-

gai és köztitermékei. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás ezen peptidek elõállítására és gyógyszerészeti termékek elõállítására történõ felhasználásuk.

A leírás terjedelme 12 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.

1

HU 008 251 T2

A találmány tárgyát képezi karboxiterminálison (C¹terminálison) amidált peptidek elõállítása C¹terminálison amidált lizinnel, elõnyösen GLP¹1 biológiai aktivitásával, valamint ezek kémiai, illetve biotechnológiai elõanyagai és köztitermékei, eljárás ezek elõállítására, valamint alkalmazásuk gyógyszerészeti termékek elõállítására. Diabéteszben vagy elhízásban szenvedõ betegek száma világszerte egyre nagyobb arányban nõ. Várható, hogy azokat a gyógyszereket, amelyek gyógyászatilag igen hasznosnak bizonyulnak ezen a terápiás területen, egyre jobb minõségben és egyre nagyobb mennyiségben kell hogy gyártsák. Az US 2004/0106547 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben exendinbõl származtatott peptideket ismertetnek, amelyek vércukorszint-csökkentõ hatásuk révén diabétesz vagy más olyan anyagcserezavaroknál, amelyek például elhízáshoz vezethetnek, gyógyszerként fontos szerepet játszhatnak. Fiziológiás hatásmechanizmusuk alapján jelenleg elõnyösen úgy vélik, hogy hatásukra diabétesz késõi következményei kevésbé vagy jelentõsen késõbb alakulnak ki. Az US 2004/0106547 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetett peptidek egy vagy több C¹terminális lizin – amelyek révén a C¹terminális vég amidálva van – bevitelével mutatkoznak különösen hatásosnak. Ilyen peptidek elõállítására az US 2004/0106547 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben különbözõ elõállítási eljárásokat írnak le. Az egyik egy biotechnológiai eljárás, amely során élesztõben történõ intracelluláris expressziót követõen a végtermékfehérjét a feltárt sejtekbõl izolálják. C¹Terminálison amidált peptideket mikroorganizmusok azonban csak nyomokban állítanak elõ, így egy olyan biotechnológiai eljárás, mint amelyet az US 2004/0106547 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben javasolnak, csak nagy ráfordítással, költségesen valósítható meg. Egy másik lehetõségként a bejelentésben a peptidek teljes kémiai szintézisét írják le. Egy módosított Merryfield-szintézist javasolnak, amely azonban szintén nagy ráfordítást igényel és igen költséges. Ennek oka többek között abban áll, hogy a szintézishez alkalmazott aminosavakat elõször elõ kell állítani és tisztítani kell, majd csak kémiai módosításokat követõen alkalmazhatók a peptidszintézisben specifikusan reaktánsként. A szintézis végén a védõcsoportokat el kell távolítani, és a célpeptidet, illetve a terméket tisztítani kell, mielõtt gyógyszerként kiszerelnék. A kémiai teljes szintézis szintén nagy, és ökológiai szempontból kedvezõtlen ráfordításokkal végezhetõ el. Már régóta ismeretesek olyan enzimek, amelyek peptidek C¹terminálisát amidálni képesek. Ezeket az enzimeket peptidilglicin a¹amidáló enzimnek (PAM) nevezik [Eipper és munkatársai, Mol. Endocrinol., 1(11), 777–790 (1987)]. Ilyen PAM-enzimek elõállítása és tisztítása a szakember számára ismert, és részletesen ismertetik. Ilyen enzimkészítmények továbbá gyakran

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

kereskedelmi forgalomban is kaphatók [például Ohsuye, K. és munkatársai, Cytotechnology, 31, 85–94 (1999); US4708934, US5789234, US6255067, US6319685, JP0177184]. Bradbury és munkatársai [Bradbury és munkatársai, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112(2), 372–377 (1983)] in vitro kimutatták, hogy PAM szubsztrátként elõnyösen olyan peptideket ismer fel, amelyek C¹terminális végét glicin alkotja. Leírták továbbá, hogy bázisos aminosavak glicinhez képest N¹terminális helyzetben a PAM reakciósebességét jelentõsen csökkentik. Azt tapasztaltuk, hogy azokat az exendinszármazékokat, amelyek C¹terminális szekvenciája bázisos aminosav, elõnyösen oligo- vagy polilizinszekvencia, amely továbbá C¹terminális glicint is hordoz, PAM szubsztrátként meglepõen jól felismeri. Ezáltal meglepõ módon a találmány szerint amidált peptidek lényegesen költséghatékonyabb biotechnológiai elõállítása lehetséges, elõnyösen olyan amidált peptideké, mint amelyeket az US 2004/0106547 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetnek, ahol a kívánt termék a C¹terminálisán glicinnel meghosszabbított prekurzor peptidbõl/fehérjébõl egyetlen enzimes lépéssel állítható elõ. A találmány szerinti eljárással biológiailag aktív peptidek állíthatók elõ, amelyek egy vagy több bázisos aminosavat, elõnyösen lizint, hisztidint és/vagy arginint, elõnyösen lizint tartalmaznak egy C¹terminális lizinnel, amely révén az utolsó C¹terminális lizin C¹terminálison amidált. Elõnyösen a találmány szerinti eljárással elõállított peptidek GLP-1, exendin¹4 vagy ezek biológiailag aktív analógjainak vagy származékainak biológiai aktivitásával bírnak. A találmány elõnyösen az US 2004/0106547 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 2. számú vegyületének biotechnológiai elõállítására szolgál. A 2. számú vegyület szekvenciája (1. azonosító számú szekvencia): NH2¹HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2 A találmány tárgyát képezi eljárás a II általános képletû, C¹terminálison amidált peptidek elõállítására (AS)n–Xm–NH2 (II képlet), ahol AS jelentése egy vagy több genetikailag kódolható aminosav, n értéke 5–2000, elõnyösen 10–1000, elõnyösebben 15–500, elõnyösebben 20–400, és (AS)n és/vagy (AS)n–Xm jelentése egy biológiailag aktív peptid, illetõleg fehérje, X jelentése egy vagy több bázisos aminosav vagy ezek származékai, elõnyösen lizin, hisztidin és/vagy arginin, elõnyösen lizin, m értéke 1–15, elõnyösen 3–10, elõnyösebben 6–8, és n és m jelentése egész számok, és amely eljárás során a) a találmány szerinti gazdasejteket egy alkalmas tápközegben szaporítjuk, b) a találmány szerinti peptideket expresszáljuk,

1

HU 008 251 T2

c) adott esetben a találmány szerinti peptideket egy alkalmas prekurzor peptidbõl enzimes hasítással felszabadítjuk, d) a b) lépésbõl származó expressziós termékeket, vagy a c) lépésbõl származó köztitermékeket – adott esetben tisztítást követõen – egy a¹amidáló enzimmel a II általános képletû vegyületekké alakítjuk, és e) a II általános képletû vegyületeket alkalmas módon tisztítjuk, elõnyösen preparatív kromatográfiás eljárásokkal. A szakember számára tudott, hogy ismert biokémiai, illetõleg biofizikai elválasztási eljárások kombinációja is a kívánt tisztítási eredményt hozhatja. A találmány szerinti eljárás a 2. azonosító számú szekvencia szerinti, I képletû vegyületek elõállítására szolgál: NH 2 ¹HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKKG (2. azonosító számú szekvencia), valamint ezek biológiailag aktív származékai elõállítására, amelyek homológiája legalább 60%, elõnyösen 80%, elõnyösebben 90%. Elõnyösen a találmány szerinti eljárás C¹terminálison amidált peptidek, az 1. azonosító számú szekvencia szerinti vegyületek elõállítására szolgál. A találmány szerinti eljárással a mikroorganizmusok azon képességét használjuk ki, hogy heterológ peptideket/fehérjéket képesek elõállítani. E célból a kívánt peptid¹/fehérjeszekvenciát a megfelelõ DNS-szekvenciába írjuk át, amelyet egy gazdaspecifikus promoterszekvenciához kapcsolunk. Az expressziós módszertõl függõen a célpeptid úgy expresszálható, hogy a sejtek intracellulárisan közvetlenül vagy fúziós fehérjeként közvetett módon állítsák elõ. A fúziós fehérje akár közvetlenül átalakítható PAM-mal, mielõtt kémiailag vagy enzimesen a kívánt célfehérjévé alakítanánk, vagy fordított sorrendben elõször a fúziós részt hasítjuk le, mielõtt a PAM-mal történõ reakcióban az amidálás megtörténik. Amennyiben fúziós stratégiát választunk, a szakember számára ismert, hogy a fúziós partnereket egy hídként szolgáló résszel össze kell kötni, hogy így a partnerek hasítása lehetõvé tegye, hogy a Lys–Xm–Gly taggal meghosszabbított célpeptid N¹terminálisa a feldolgozás után megfelelõ módon rendelkezésre álljon. A hídként szolgáló rész kialakítására sokféle lehetõség kínálkozik. Amennyiben például metionin aminosavat választunk, akkor halogén-ciánnal történõ kémiai hasítás jöhet szóba. Ha pedig a híd például egy DDDDK szekvenciájú pentapeptid, akkor enterokinázzal végezhetõ el a hasítás. Az IEGR szekvenciájú tetrapeptid esetében pedig a lehasítás Xa¹faktor segítségével történhet. Megfelelõ kialakításnál az N¹terminálison hisztidinnel kezdõdõ fehérjéknél enzimként Genenase® alkalmazható. A késõbbiekben, a Példák részben az enterokinázzal történõ hasítást írjuk le. Egy másik lehetõségként akár a célpeptid is kiválasztódhat a tápközegbe – amennyiben képes a sejtbõl kitranszportálódni –, vagy fúziós fehérje formájában, vagy közvetlenül, natív formában. Ehhez géntechnológiailag módosított sejtek, fõleg mikroorganizmusok sejtjei, elõnyösen baktérium- vagy élesztõsejtek alkal-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

mazhatók. Amennyiben expressziós rendszerként baktériumsejteket választunk, fennáll továbbá az a lehetõség, hogy közvetlenül a célfehérje vagy egy megfelelõ fúziós fehérjéje, amely a célfehérjét tartalmazza, a periplazmába vagy a tápközegbe választódjon ki. A szakember számára alapvetõen ismertek a rendelkezésre álló gazdaszervezetek és eljárások. Ezek nagyrészt a széles körû kínálatból, kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk. Példaként a New England Biolabs, az Invitrogen és a Roche cégek említhetõk. Ezen cégek katalógusában irodalmi hivatkozások találhatók, amelyek bepillantást nyújtanak ezekbe a technológiákba. A szakember számára az is ismert, hogy az alkalmazható mikroorganizmusok köre állandóan bõvül, ugyanúgy, mint a biotechnológiai eljárások készlete. A találmány tárgyát képezik az ebben a tekintetben specializált kiviteli formák is. Példaként a következõ gazda/vektor rendszerek nevezhetõk meg: E. coli, S. carnosus, Salmonella, Bacillus subtilis vagy Pseudomonas típusú baktériumok, K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe és S. cerevisiae típusú élesztõk. Az alábbiakban példaként az E. coli K12, illetve E. coli B jelû törzseken alapuló rendszerek alkalmazását írjuk le. A szakember számára azonban ismert, hogy ezek a példaként megnevezett rendszerek sokféle variációs lehetõséget kínálnak, amelyek alkalmas promoterek vagy más szabályozó nukleinsavszekvenciák, a gazdasejtek genetikai tulajdonságainak és az alkalmazott vektorok választásából adódnak (pl. a DNS kópiaszáma, szelekciós módszer stb.). A szakember számára ismert, hogy a szövegben ismertetett kiviteli példák a ténylegesen megvalósítható lehetõségeknek csak nagyon kis részét írják le. Egy másik lehetõség a PAM segítségével történõ in vitro amidálásra az, amikor az enzimet az amidálandó elõanyag-fehérjével együtt egy és ugyanazon gazdasejtben expresszáljuk. Ez úgy érhetõ el, hogy egy PAM-aktivitást kódoló génszekvenciát egy gazdaspecifikus szabályozószekvencia ellenõrzése alá viszünk be a gazdasejtekbe. Ez az expressziós szekvencia vagy stabilan a mindenkori kromoszomális DNS-szekvenciába van beépítve, vagy egy második plazmidon a célfehérje expressziós plazmidja mellett áll rendelkezésre, vagy egy második expressziós kazettában ugyanazon vektorba építve található, vagy akár egy policisztronos expressziós toldalékként a célfehérjét kódoló génszekvenciával összhangban ugyanazon promoterszekvencia ellenõrzése alá klónozható. A találmány tárgyát képezik biotechnológiai eljárások az I képletû peptidek vagy származékaik elõállítására, amelyek legalább 60%¹os, elõnyösen legalább 80%¹os, elõnyösebben legalább 90%¹os homológiát mutatnak az I képletû vegyülettel. A találmány szerinti eljárás azzal jellemezhetõ, hogy olyan rekombináns szervezeteket állítunk elõ, amelyek egy prekurzor peptidet szintetizálnak, amely végül egy enzim jelenlétében közvetlenül vagy egy vagy több bázisos aminosav vagy ezek származékai-

1

HU 008 251 T2

val, elõnyösen lizin, hisztidin és/vagy arginin aminosavakkal sorba kapcsolva, elõnyösebben lizinnel kapcsolva, amely által a C¹terminális szekvencia amidált állapotban van, az I képletû vegyületnek megfelelõ peptiddé alakítható. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti I általános képletû vegyületek vagy a II általános képletû, C¹terminálison amidált peptidek, amelyek a találmány szerinti eljárással elõállíthatók, elõnyösen az 1. vagy 2. azonosító számú szekvencia szerinti vegyületek alkalmazása egy gyógyszerészeti termék

2

vagy egy gyógyszerészeti kiszerelés elõállítására, elõnyösen szénhidrátanyagcsere-zavarok kezelésére, elõnyösen diabetes mellitus kezelésére. 5

10

Példák 1. példa: AVE1–44-Gly¹t kódoló E. coli specifikus DNS-szekvencia szintézise Elõször is az AVE1–44-Gly-peptidet (2. azonosító számú szekvencia) kódoló 3. azonosító számú szekvencia szerinti génszekvenciát állítottuk elõ.

3. azonosító számú szekvencia

TTTTTTAAGCTTG CACGGTGAAG GTACCTTCAC CTCCGACCTG TCCAAACAGA TGGAAGAAGA AGCTGTTCGT CTGTTCATCG AATGGCTGAA AAACGGTGGT CCGTCCTCCG GTGCTCCGCC TTCGAAAAAG AAGAAAAAGA AAGGT TGATA ATAGCATGCA CGTGCGGCCG CACCTGGTCGA CGAATTCAAA AAAA A génszekvenciát PCR-technikával szintetizáltuk. Ehhez a következõ 5 láncindítót kémiai DNS-szintézis- 20

sel állítottuk elõ. Ezeket a szintéziseket Expedite™ DNS-szintézis-rendszerrel végeztük el.

a) A zp5u-láncindító szekvenciája (4. azonosító számú szekvencia):

5’-TTTTTTAAGC TTGCACGGTG AAG-3’ A 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia a kódoló („sense”) szál 1–23 részét tartalmazza.

25

b) A zp3a-láncindító szekvenciája (5. azonosító számú szekvencia):

5’-CTTCCATCTG TTTGGACAGG TCGGAGGTGA AGGTACCTTC ACCGTGCAAG CTTAAAAAA-3’ Az 5. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia a nem kódoló szál („antisense”) 1–59 részét tartalmazza. c) A zp3b-láncindító szekvenciája (6. azonosító számú szekvencia):

5’-GGACGGACCA CCGTTTTTCA GCCATTCGAT GAACAGACGA ACAGCTTCTT CTTCCATCTG TTTGGACAG-3’ A 6. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia a nem kódoló szál („antisense”) 40–108 részét tartalmazza.

40

d) A zp3c-láncindító szekvenciája (7. azonosító számú szekvencia):

5’-GTGCATGCTA TTATCAACCT TTCTTTTTCT TCTTTTTCGA AGGCGGAGCA CCGGAGGACG GACCACCGTT TTTC-3’ A 7. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia a nem kódoló szál („antisense”) 91–164 részét tartalmazza. e) A zp3d-láncindító szekvenciája (8. azonosító számú szekvencia):

5’TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGCGGCCG CACGTGCATG CTATTATCAA CCTT¹3’ A 8. azonosító számú szekvencia szerinti szekvencia a nem kódoló szál („antisense”) 144–197 részét tar- 55 talmazza. A láncindítókkal egymás után 4 PCR-reakciót végeztünk standard körülmények között, 54 °C¹on. Az 1. reakcióban 100-100 ng zp3a- és zp5u-láncindítót alkalmaztunk. A PCR-reakcióban 5 ciklust hajtottunk végre. 60 4

A második reakcióban a reakció 1/40¹ét 100-100 ng zp5u- és zp3b-láncindítókkal 10 ciklusban alkalmaztuk. A 3. reakcióban a 2. reakció termékének 1/40-ével, 100-100 ng zp5u- és zp3c-láncindítókkal további 10 ciklust végeztünk. Végül 25 PCR-ciklusban a 3. reakció termékének 1/40-ével és a zp5u- és zp3d-láncindítókkal megszintetizáltuk a kívánt DNS-fragmenst,

1

HU 008 251 T2

amelynek hosszát gélelektroforézissel ellenõriztük. A kívánt DNS-fragmenst tisztítottuk, és EcoR1, majd Hind3 restrikciós enzimekkel emésztettük a gyártó útmutatása szerint (New England Biolabs). Ezzel párhuzamosan a pUC19-plazmidot (New 5 England Biolabs) EcoR1- és Hind3-enzimekkel emésztettük. Az emésztési elegy fragmenseit 1,2%¹os agarózgélen elválasztottuk, majd a pUC19-bõl a vektorfragmenst és a 4. reakcióból a kívánt terméket izoláltuk. A tisztított fragmenseket T4¹ligáz-reakcióban egy 10 éjszakán át, 16 °C¹on egymáshoz ligáltuk. Ezt követõen kompetens E. coli-sejteket (Stratagene, E. coli XL 10 Gold törzs) a ligálási eleggyel transzformáltunk és 25 mg/l ampicillint tartalmazó agarlemezekre terítettünk. Egyedi telepekbõl plazmid-DNS¹t izoláltunk, és 15 DNS-szekvencia-vizsgálattal jellemeztük. A kívánt fragmens plazmid-DNS¹e a pSCHPUCZP10 jelölést kapta. Ez szolgált kiindulási anyagként a talál-

2

mány szerinti prekurzor peptidek E. coli K12 sejtekben történõ szintézisére szolgáló expressziós vektorok elõállításához. 2. példa: Az AVE1–44-Gly jelû prekurzor peptidet kódoló expressziós vektorok elkészítése Az AVE1–44-Gly jelû peptid elõállítása érdekében a kódolószekvenciát az Invitrogen cég pThioHisA-vektorába vittük be (katalógusszám K360–01). Egy fúziós fehérje keletkezett thioredoxinból és az AVE1–44-Gly prekurzor peptidbõl, amelyek enterokináz által felismert szekvenciával (DDDDK) kapcsolódnak össze. Enterokinázzal (Invitrogen) történõ reakcióval az AVE1–44-Gly¹t felszabadítottuk, majd a 7. példában (alább) ismertetettek szerint PAM jelenlétében (Wako Pure Chemicals Ind., Ltd) az AVE1–44 NH2 célfehérjévé alakítottuk. A következõ szekvenciájú két láncindítót szintetizáltuk:

A „Zp_thiohisf” jelû láncindítót egy BamHl-hasítóhellyel (9. azonosító számú szekvencia):

5’-TTTTTTGGAT CCGGTGATGA CGATGACAAG CACGGTGAAG GTACCTTC-3’ A „ZP_thiohisrev” jelû láncindítót egy EcoR-hasítóhellyel (10. azonosító számú szekvencia):

5’-TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGC-3’ PCR-reakciót végeztünk templátként pSCHPUCZP10 DNS-ével és Zp_thiohisf- és ZP_thiohisrev-láncindítókkal standard körülmények között. Egy PCR-fragmens keletkezett, amelyet BamHI- és EcoRIenzimekkel történõ hasítást követõen közvetlenül a – BamHI-gyel és EcoRI-gyel felnyitott – pTHlOHisA-vektorba építettünk T4¹ligáz-reakcióval. Kompetens E. coli BL21 sejteket a ligálási keverékkel transzformáltunk és 25 mg/l ampicillint tartalmazó, szelektív agarra terítettünk. Néhány klónból plazmid-DNS¹t izoláltunk, és PCR¹, majd DNS-szekvencia-vizsgálat segítségével vizsgáltuk. A kívánt, pozitív klónokban, amelyeket pTHIOHisAZP10Gly-nek neveztünk, az US5496924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 14. példájához hasonló módon vizsgáltuk a fúziós fehérje expresszióját. A pozitív expressziós vizsgálat alapján kivá-

25

30

35

40

lasztottunk egy klónt, és nagyobb anyagmennyiség elõállítása céljából fermentáltuk. A keletkezett fúziós fehérje tartalmazza a thioredoxint, amely egy enterokináz által felismert szekvenciával kapcsolódik az AVE1–44-Gly-hez (12. azonosító számú szekvencia). Az US5496924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben egy expressziós rendszert javasolnak, amely alapvetõen méretre vágott fúziós fehérjék elõállítását teszi lehetõvé. Ennek a rendszernek az elõnye abban áll, hogy fúziós fehérjék kis ballasztrésszel állíthatók elõ. Amennyiben A–B-szekvenciaszakaszokat enterokinázfelismerõ szekvencián (DDDDK) keresztül AVE1–44-Gly-vel fuzionálunk, akkor a következõ gén- és aminosavszekvenciájú fúziós fehérjét kapjuk (11. és 12. azonosító számú szekvenciák):

11. azonosító számú szekvencia

GGAAACAGAATTC ATG GCGCCGA CCTCTTCTTC TACCAAAAAG CTCAACTGC AACTGGAACA CCTGCTGCTG GACCTGCAGA TGATCCTGAA CGGTATCAAC AACTACAAAA ACCCGAAACT GACGCGTATC GACGATGACG ATAAACACGG TGAAGGTACC TTCACCTCCG ACCTGTCCAA ACAGATGGAA GAAGAAGCTG TTCGTCTGTT CATCGAATGG CTGAAAAACG GTGGTCCGTC CTCCGGTGCT CCGCCTTCGA AAAAGAAGAA AAAGAAAGGT TGATAATAGC ATGCACGTGC GGCCGCAAGC TTAAAAAA 12. azonosító számú szekvencia

MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGT FTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKKKG A kódoló génszekvenciát PCR-technológiával állítottuk elõ. Ehhez a következõ láncindítókat szintetizáltuk:

55

1) psw3_zpcolf-láncindító (13. azonosító számú szekvencia):

5’-CGTATCGACG ATGACGATAA ACACGGTGAA GGTACCTTC-3’ 5

1

HU 008 251 T2

2

A láncindító szekvenciája lefedi az enterokinázfelismerõ helyet és az AVE1–44-Gly elejét kódoló szekvenciát. 2) psw3_zpcolrev-láncindító (14. azonosító számú szekvencia):

5’-GTGTTTATCG TCATCGTCGA TACGCGTCAG TTTCGG-3’ A szekvencia a szintetikus interleukin–2 szekvenciájának felel meg, amely az US5496924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés I táblá- 10 zatának megfelelõen a 34–38 aminosavakat, valamint a metionin aminosav kodonjának 2/3¹át fedi le. A láncindító szekvenciájának többi része a psw3_zpcolf-láncindítóval fed át.

3) pBprimef1 (15. azonosító számú szekvencia):

5’-TGAGCGGATA ACAATTTCAC AC-3’ A láncindító 5’¹irányban hibridizál a pK50-plazmidban található EcoRI-hasítóhellyel (US5496924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 33. ábrája).

4) psw3_zp10colrev Hind3-hasítóhellyel (16. azonosító számú szekvencia):

5’-TTTTTTAAGC TTGCGGCCGC ACGTGCATGC TATTATCAAC CTTC-3’ Két PCR-reakciót végeztünk egymással párhuzamosan. Az egyiket a pK50-plazmid DNS¹én végeztük a pBprimef1- és a psw3_zpcolrev-láncindítókkal 50 °C¹on, míg a másik reakciót a psw3_zpcolf- és psw3_zp10colrev-láncindítókkal végeztük 54 °C¹on a pTHIOHisAZP10-Gly-plazmid DNS¹én. A PCR-termékeket gélelektroforézissel történõ elválasztást követõen tisztítottuk, mindkettõbõl egy kis részt 1:1 arányban kevertünk, és egy harmadik PCR¹t végeztünk a pBprimef1- és a psw3_zp10colrev-láncindítókkal. A PCR-terméket EcoR1- és Hind3-enzimekkel emésztettük, és az ezzel egy idõben ugyanezen enzimekkel felnyitott pK50-plazmidba T4¹ligáz-reakcióval beépítettük. Kompetens E. coli BL21 sejteket a ligálási keverékkel transzformáltunk és 25 mg/l ampicillint tartalmazó, szelektív agarra terítettünk. Néhány klónból visszaizoláltuk a plazmid-DNS¹t, és PCR¹, majd DNS-szekvencia-vizsgálattal ellenõriztük. A pozitív klónokat pBZP100-nak neveztük, és a fúziós fehérje expresszióját ellenõriztük. Az expressziós terméket tömegspektrometriával és SDS-PAGE segítségével vizsgáltuk, és az N¹terminálist fehérjeszekvencia-vizsgálattal meghatároztuk. Nagyobb mennyiségû anyag fermentálása céljából egy alkalmas klónt kiválasztottunk. 3. példa: A 2. példában elõállított törzsek fermentációja Különbözõ, a célpeptidszármazékokat (fúziós fehérjéket) kódoló plazmidvektorokkal transzformált E. coli BL21 sejteket ásványisó-tápközegben vagy teljes tápközegben (lásd 1. példa), fermentorban tenyésztettünk 30 °C¹on vagy 37 °C¹on, 7,0 pH¹értéknél. A pH beállítását NH4+-oldattal végeztük (26%¹os, vízben). A tenyészet levegõztetését oly módon szabályoztuk, hogy az oldott oxigén mennyiségét a tápközegben állandóan 30%¹on tartottuk. Ásványisó-tápközegben a rátáplálásos szakaszos folyamatnál („fed batch”) a szakaszos („batch”) fázis vége után glükózoldatot (60% tömeg/térfogat) adagoltunk (8 g/l/h¹tól 26 g/l/h¹ig). A fehérjeexpresszió indukálása IPTG hozzáadásával történt [1–4 mM végkoncentráció (f. c.)]. Az indukálási idõ

20

25

30

35

40

45

6–8 óra. A célfehérje expresszióját SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel (SDS-PAGE) mutattuk ki. Az AVE 1–44 -Gly (fúziós fehérje) E. coli BL21/pBZP100 sejtekben történt expresszióját a következõkben leírtak szerint végeztük. E. coli BL21 sejtek –80 °C¹on tárolt törzstenyészetébõl 100 ml sejtszuszpenziót vettünk ki, és 0,5 l teljes tápközegben, 37 °C¹on rázatva, 10–16 órán keresztül inkubáltuk. A fermentorban a fõfermentációs tenyészetet 0,01–0,05 OD 600 oltási sûrûségû, megfelelõ mennyiségû inokulummal oltottuk. Inokulum tápközeg: 5 g/l Bacto trypton 10 g/l élesztõkivonat 5 g/l NaCl Fõfermentációs tápközeg: Meghatározott ásványisó-tápközeg (minimáltápközeg) szénforrásként glükózzal [Jeffrey, H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] A fõfermentációs tápközegben lévõ kezdeti glükóz elfogyása után glükózoldatot tápláltunk rá. A fehérjeexpressziót IPTG (1 mM végkoncentráció, f. c.) hozzáadásával indukáltuk, és a fúziós fehérje maximális expresszióját az indukálást követõen figyeltük meg. Például Novex cég SDS-PAGE vizsgálati rendszerének alkalmazása esetén (NuPage® Novex 12% gélrendszer, Invitrogen™) a fermentáció folyamán 0,02–0,02 OD600 sûrûségû sejtszuszpenziót vettünk ki a fermentorból különbözõ tenyésztési idõpontokban, és vizsgáltuk a gyártó útmutatásainak megfelelõen.

50

55

60 6

4. példa: A fúziós fehérje tisztítása A BZP-AVE1–44-Gly-fúziósfehérje tisztítása Rekombináns E. coli-törzs 200 g tömegû biomasszáját 300 ml Tris-pufferben (50 mM Tris/HCl, pH=7,4; 1 mM EDTA) szuszpendáltuk. A sejtfeltárást kétszeri nagynyomású homogenizálással végeztük (Rannie nagynyomású homogenizátor, 1000 bar). A homogenizátumban lévõ oldhatatlan alkotórészeket centrifugálással választottuk el. A felülúszót présszûrõn szûrtük (Sartorius 0,22 mm filter, 111¹es típus), és elõzõleg

1

HU 008 251 T2

pufferrel (50 mM Tris/HCL pH=7,3; 1 mM EDTA) ekvilibrált kromatográfiás oszlopra (Source S, Amersham Biosciences) vittük fel. A minta felvitelét követõen ekvilibrálópufferrel mostuk az oszlopot (2 oszloptérfogat), amelyet egy további mosási lépés követett10% nagy sótartalmú pufferrel (50 mM Tris/HCl pH=7,3; 1 M NaCl, 1 mM EDTA). A frakcionálást sógradiens kialakításával végeztük 5 oszloptérfogatnyi nagy sótartalmú pufferrel. Az egyes frakciók fúziósfehérje-tartalmát SDS-gélelektroforézissel ellenõriztük (NuPage® Novex 12% gélrendszer, Invitrogen). A fúziósfehérje-tartalmú frakciókat egyesítettük, és 5–10-szeresre koncentráltuk (Millipore ultraszûrõ, 10 kDa vágási értékû membrán). A koncentrátumot enterokináz pufferre történõ puffercserét követõen (50 mM Tris/HCl pH=7,4; 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2) közvetlenül alkalmaztuk a proteázhasítási reakcióban, vagy a hasítási reakció elõtt még gélszûréssel tisztítottuk (Superdex 75, Amersham Biosciences). A fúziós fehérje enterokinázzal (Invitrogen) történõ hasítását enterokináz pufferben (20 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH=7,4) végeztük a gyártó útmutatásai alapján. 5. példa: A 3. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát tartalmazó thioredoxin-fúziósfehérje tisztítása Rekombináns E. coli-törzs 200 g tömegû biomasszáját 50 mM Tris-pufferben szuszpendáltuk (pH=7,4; 1 mM EDTA). A sejtfeltárást kétszeri nagynyomású homogenizálással végeztük (Rannie nagynyomású homogenizátor, 1000 bar). A homogenizátumban lévõ oldhatatlan alkotórészeket centrifugálással választottuk el. A felülúszót présszûrõn szûrtük (Sartorius 0,22 mm filter, 111¹es típus), és elõzõleg pufferrel (50 mM Tris/HCL pH=7,4; 1 mM EDTA) ekvilibrált kromatográfiás oszlopra (Source Q, Amersham Biosciences) vittük fel. A minta felvitelét követõen ekvilibrálópufferrel mostuk az oszlopot (2 oszloptérfogat), majd a frakcionálást sógradiens kialakításával végeztük 6 oszloptérfogatnyi nagy sótartalmú pufferrel (50 mM Tris/HCl pH=7,4; 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA). Az egyes frakciók fúziósfehérje-tartalmát SDS-gélelektroforézissel ellenõriztük. (NuPage® Novex 12% gélrendszer, Invitrogen™). A fúziósfehérje-tartalmú frakciókat egyesítettük, és 5–10-szeresre koncentráltuk (Millipore ultraszûrõ, 10 kDa vágási értékû membrán). A koncentrátumot gélszûrési kromatográfiával (Superdex 75, Amersham Biosciences) tovább frakcionáltuk. Egy elõzõleg ekvilibrált oszlopra (50 mM Tris/HCl, pH=7,4; 200 mM NaCl) a koncentrált fúziósfehérje-oldatot 5% oszloptérfogat mennyiségig felvittük. A lemosást ekvilibrálópufferrel történõ mosással végeztük. Az egyes frakciók fúziósfehérje-tartalmának ellenõrzését ismét SDS-gélelektroforézissel végeztük (NuPage® Novex 12% gélrendszer, Invitrogen™). A megfelelõ frakciókat egyesítettük, körülbelül 5 mg/ml koncentrációra koncentráltuk (Vivaspin koncentrátor, 10 kDa vágási érték, Vivascience), és diafiltrációs betét (Vivascience) segítségével lecseréltük a puffert enterokináz pufferre (20 mM Tris/HCl pH=7,4; 50 mM NaCl).

2

Az AVE1–44-Gly-elõanyag ezt követõ, enterokinázzal történõ feldolgozása a 4. példában ismertetettekkel azonos. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

6. példa: Az enterokinázzal történõ hasítási reakcióból származó hasítási termékek elválasztása A fúziós fehérjék enterokinázzal történõ hasítását követõen a hasítási termékeket ioncserélõ kromatográfiával választottuk el egymástól (Source 30S, Amersham Biosciences). Az oldat ionerõsségét kb. 10 mS/cm¹re állítottuk nátrium-klorid hozzáadásával. A fehérjeoldatnak az elõzõleg ekvilibrált oszlopra (20 mM Tris/HCl, pH=7,4, NaCl-dal körülbelül 10 mS/cm vezetõképességre állítva) történõ felvitelét követõen a nem kötõdött anyagokat pufferrel lemostuk (20 mM Tris/HCl, pH=7,4, NaCl-dal körülbelül 10 mS/cm vezetõképességre állítva). Az AVE1–44-Glypeptid elúciója gradiens kialakításával történt 10 oszloptérfogaton keresztül 500 mM NaCl-koncentrációig. Az AVE1–44-tartalmú frakciók vagy az AVE1–44elõanyagainak azonosítása SDS-gélelektroforézissel, HPLC-vel és tömegspektrometriával történt. A megfelelõ frakciókat egyesítettük, és a szerves oldószer eltávolítását követõen liofilizáltuk. Az aminosavszekvencia meghatározása érdekében az izolált AVE1–44-Gly¹n végezetül teljes Edman-szekvenálást végeztünk. 7. példa: Az AVE1–44-Gly átalakítása AVE1–44¹NH2¹vé A reakciót PAM-enzimmel végeztük [peptidilglicinamidáló enzim, Wako Pure Chemicals Ind., Ltd. (rend. szám: 161–16971)] a gyártó által megadott reakciókörülmények között. A következõ oldatot alkalmaztuk: 1 mM CuSO4 5 mM KI 3 mM Na¹aszkorbát 230 U/ml kataláz (marhaeredetû, Fluka) 600 U/ml PAM (Wako Chemicals) 0,1 M Tris/HCl pH=7,0, 0,001% Triton X¹100-zal Az oldatot 37 °C¹on, 1 órán keresztül elõinkubáltuk, majd az AVE 1–44 -Gly-fehérjeoldatot adtuk hozzá (Tris/HCl, pH=7,0, 80 mg/ml végkoncentráció). A reakciókeveréket 37 °C¹on tovább inkubáltuk. A reakció alakulását különbözõ idõpontokban vett mintavételekkel követtük nyomon. Maximális átalakulásnál a reakciót 50 mM EDTA-oldattal állítottuk le. A reakciókeveréket ezt követõen ioncserélõ kromatográfiával választottuk el [Shodex cég, IEC CM¹825 típusú oszlop (8×75 mm)]. Az oszlopra a következõ gradienst vittük: A-eluens – 40 mM foszfátpuffer pH=7 +20% acetonitril B-eluens – 50 mM foszfátpuffer pH=7 +1 M NaCl Az oszlopot szobahõmérsékleten, 2 ml/perc vagy 1 ml/perc átfolyási sebességgel használtuk. Az eluálódott frakciókat felfogtuk (280 nm¹nél detektáltuk), és a mindenkori peptid tömegét MALDI-MSsel határoztuk meg. A tömegspektrometriás vizsgálato-

1

HU 008 251 T2

kat BRUKER Reflex IV típusú készülékkel végeztük. A mintákat közvetlenül alkalmaztuk MALDI¹MS vizsgálathoz, illetve körülbelül 50 pmol/ml koncentrációra hígítva 50% vizes TA¹oldattal [(1+1) 0,1% trifluorecetsav+50% acetonitril]. Az AVE1–44¹NH2¹re várt tömeget sikerült igazolni. A kapott termék további gyógyszerészeti alkalmazásra felhasználható. Gyógyszerészeti kiszerelések alkalmas gyógyszerészeti kiszerelést segítõ anyagoknak a biológiailag aktív peptidhez, illetve peptidszármazékhoz történõ hozzáadásával a szakember számára ismert módon elõállíthatók.

2

A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása 1. azonosító számú szekvenciához: <223> Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus 5 peptid; MOD_RES K44 amidálás 2. és 12. azonosító számú szekvenciához: <223> Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus peptid 3. és 11. azonosító számú szekvenciához: <223> Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus 10 DNS 4–10. és 13–16. azonosító számú szekvenciához: <223> Mesterséges szekvencia leírása: láncindító

Szekvencialista <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Verfahren zur Herstellung von Carboxy terminal amidierten Peptiden mit GLP1 Wirkung <130> DEAV2004/0076 <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetisches Peptid; MOD_RES K44 Amidation <400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetisches Peptid <400> 2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly 35 40 45 <210> 3 <211> 198 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetische DNA 8

HU 008 251 T2

<400> 3

ttttttaagc agaagctgtt gccttcgaaa tcgacgaatt

ttgcacggtg aaggtacctt cacctccgac ctgtccaaac agatggaaga cgtctgttca tcgaatggct gaaaaacggt ggtccgtcct ccggtgctcc aagaagaaaa agaaaggttg ataatagcat gcacgtgcgg ccgcacctgg caaaaaaa

60 120 180 198

<210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer <400> 4

ttttttaagc ttgcacggtg aag

23


cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa

59


ggacggacca ccgtttttca gccattcgat gaacagacga acagcttctt cttccatctg tttggacag

60 69


gtgcatgcta ttatcaacct ttctttttct tctttttcga aggcggagca ccggaggacg gaccaccgtt tttc

60 74


ttttttgaat tcgtcgacca ggtgcggccg cacgtgcatg ctattatcaa cctt <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer

9

54

HU 008 251 T2

<400> 9

ttttttggat ccggtgatga cgatgacaag cacggtgaag gtaccttc

48


ttttttgaat tcgtcgacca ggtgc

25

<210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetische DNA <400> 11

ggaaacagaa acacctgctg actgacgcgt caaacagatg gtcctccggt tgcggccgca

ttcatggcgc ctggacctgc atcgacgatg gaagaagaag gctccgcctt agcttaaaaa

cgacctcttc agatgatcct acgataaaca ctgttcgtct cgaaaaagaa a

ttctaccaaa gaacggtatc cggtgaaggt gttcatcgaa gaaaaagaaa

aagactcaac aacaactaca accttcacct tggctgaaaa ggttgataat

tgcaactgga aaaacccgaa ccgacctgtc acggtggtcc agcatgcacg

60 120 180 240 300 321

<210> 12 <211> 90 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetisches Peptid <400> 12

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu 35 40 45 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val 50 55 60 Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala 65 70 75 80 Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly 85 90 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer <400> 13

cgtatcgacg atgacgataa acacggtgaa ggtaccttc

10

39

1

HU 008 251 T2

2


gtgtttatcg tcatcgtcga tacgcgtcag tttcgg

36


tgagcggata acaatttcac ac

22


ttttttaagc ttgcggccgc acgtgcatgc tattatcaac cttc

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás C¹terminálison amidált, (II) általános képletû peptidek elõállítására (AS)n–Xm–NH2 (II képlet), ahol AS jelentése egy vagy több, genetikailag kódolható aminosav; n értéke 5–2000, elõnyösen 10–1000, elõnyösebben 15–500, legelõnyösebben 20–400; és (AS)n és/vagy (AS)nXm jelentése elõnyösen egy biológiailag aktív peptid vagy fehérje; X jelentése egy vagy több bázisos aminosav vagy ezek származéka, elõnyösen lizin, hisztidin és/vagy arginin, elõnyösebben lizin; m értéke 1–15, elõnyösen 3–10, elõnyösebben 6–8; n és m jelentése egész számok, és ahol a) gazdasejteket alkalmas tápközegben tenyésztünk, b) alábbi (I) általános képletû vegyületet expresszálunk (AS)n–XmYp (I képlet), ahol Y jelentése egy vagy több semleges töltésû aminosav, elõnyösen glicin, p értéke 1–10, elõnyösen 1–5, elõnyösebben 1,

30

35

40

45

50

55

11

44

c) adott esetben az (I) képletû vegyületet egy alkalmas prekurzor peptidbõl enzimes vagy kémiai hasítással felszabadítjuk; d) a b) lépésbõl származó expressziós terméket, vagy a c) lépésbõl származó köztiterméket – adott esetben egy tisztítási lépést követõen – egy a¹amidáló enzimmel (PAM) reagáltatjuk, és e) a (II) általános képletû, C¹terminálison amidált peptidet alkalmas módon tisztítjuk, elõnyösen preparatív kromatográfiás eljárással. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az (I) képletû vegyület a 2. azonosító számú szekvencia által meghatározott, valamint legalább 60%¹os homológiával bíró, biológiailag aktív származékai. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont közül egy vagy több szerinti eljárás, ahol az (I) képletû vegyületet egy alkalmas prekurzor peptidbõl enzimes hasítással szabadítjuk fel. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az (I) képletû vegyületet egy alkalmas prekurzor peptidbõl enterokináz enzimmel szabadítjuk fel. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás (II) képletû vegyület elõállítására, amely vegyület az 1. azonosító számú szekvencia által meghatározott.

Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents